Иммуномодулятор метаболитлар шеш микротирәлегенең (TME) төп үзенчәлеге булып тора, ләкин берничә искәрмәдән тыш, аларның шәхесе әлегә билгесез. Монда без югары дәрәҗәдәге сероз карцинома (HGSC) белән авыручыларның шешләреннән һәм асцитларыннан шешләрне һәм Т күзәнәкләрен анализладык, бу төрле TME бүлекләренең метаболомын ачыкладык. Асцит һәм шеш күзәнәкләренең метаболитлары зур аермаларга ия. Асцит белән чагыштырганда, шешкә үтеп керүче Т күзәнәкләре 1-метилникотинамидка (MNA) шактый бай. Т күзәнәкләрендә MNA дәрәҗәсе югары булса да, никотинамид N-метилтрансферазасының (S-аденозилметиониннан никотинамидка метил төркемнәрен күчерүне катализлаучы фермент) экспрессиясе фибробластлар һәм шеш күзәнәкләре белән чикләнә. Функциональ яктан, MNA Т күзәнәкләрен шешне стимуллаштыручы цитокин шеш некрозы факторы альфасын бүлеп чыгарырга этәрә. Шуңа күрә, TMEдан алынган MNA Т күзәнәкләренең иммун көйләүенә өлеш кертә һәм кеше яман шешен дәвалау өчен потенциаль иммунотерапия максаты булып тора.
Шештән алынган метаболитлар шешкә каршы иммунитетка тирән тоткарлаучы йогынты ясый ала, һәм күбрәк дәлилләр аларның авыру үсеше өчен төп этәргеч көч булып хезмәт итә алуын күрсәтә (1). Варбург эффектыннан тыш, соңгы вакытта шеш күзәнәкләренең метаболик халәтен һәм аның шеш микротирәлегенең (TME) иммун халәте белән бәйләнешен характерлау буенча эшләр башланды. Тычкан модельләре һәм кеше Т-күзәнәкләре буенча тикшеренүләр глутамин метаболизмының (2), оксидлашу метаболизмының (3) һәм глюкоза метаболизмының (4) төрле иммун күзәнәк төркемнәренә бәйсез рәвештә тәэсир итә алуын күрсәтте. Бу юллардагы берничә метаболит Т-күзәнәкләренең шешкә каршы функциясен тоткарлый. Тетрагидробиоптерин (BH4) коэнзимын блокадалау Т-күзәнәкләренең пролиферациясенә зыян китерергә мөмкин, ә организмда BH4 артуы CD4 һәм CD8 аша шешкә каршы иммун җавапны көчәйтергә мөмкин икәнлеге исбатланган. Моннан тыш, кинуренинның иммуносупрессив эффектын BH4 куллану белән коткарып була (5). Изоцитратдегидрогеназа (IDH) мутант глиобластомасында энантиометаболик (R)-2-гидроксиглютарат (R-2-HG) секрециясе Т күзәнәкләренең активлашуын, пролиферациясен һәм цитолиз активлыгын тоткарлый (6). Күптән түгел гликолизның өстәмә продукты булган метилглиоксал миелоид чыгышлы супрессор күзәнәкләр тарафыннан җитештерелүе, һәм метилглиоксалның Т күзәнәкләренә күчерелүе эффектор Т күзәнәк функциясен тоткарлый алуы күрсәтелде. Дәвалауда метилглиоксалны нейтральләштерү миелоидтан алынган супрессор күзәнәкләрнең (MDSC) активлыгын җиңәргә һәм тычкан модельләрендә контроль нокта блокада терапиясен синергетик рәвештә көчәйтергә мөмкин (7). Бу тикшеренүләр бергәләп ТМЭдан алынган метаболитларның Т күзәнәкләренең функциясен һәм активлыгын көйләүдәге төп ролен ассызыклый.
Т-күзәнәк дисфункциясе аналык яман шешендә киң таралган (8). Бу өлешчә гипоксиягә хас метаболик үзенчәлекләр һәм шеш кан тамырларының аномаль булуы белән бәйле (9), бу глюкоза һәм триптофанның сөт кислотасы һәм кинуренин кебек өстәмә продуктларга әйләнүенә китерә. Артык күп күзәнәктән тыш лактат интерферон-γ (IFN-γ) җитештерүне киметә һәм миелосупрессив төркемчәләрнең дифференциациясен стимуллаштыра (10, 11). Триптофан куллану турыдан-туры Т-күзәнәкләренең пролиферациясен тоткарлый һәм Т-күзәнәк рецепторлары сигнализациясен тоткарлый (12-14). Бу күзәтүләргә карамастан, иммун метаболизмы тирәсендә in vitro Т-күзәнәк культурасында оптимальләштерелгән мохит кулланып күп эш башкарылды, яки in vivo гомологик тычкан модельләре белән чикләнде, аларның берсе дә кеше яман шешләренең гетерогенлыгын һәм физиологик макро һәм микро мохитнең физиологик гетерогенлыгын тулысынча чагылдырмый.
Йомыркалык яман шешенең гадәти үзенчәлеге - перитонеаль таралу һәм асцит барлыкка килү. Асцитта күзәнәк сыекчасы туплану авыруның алга китүе һәм начар фараз белән бәйле (15). Хәбәрләргә караганда, бу уникаль бүлек гипоксик, кан тамырлары эндотелиаль үсеш факторы (VEGF) һәм индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO) югары дәрәҗәдә, һәм Т-регулятор күзәнәкләре һәм миелоид ингибитор күзәнәкләре белән инфильтрацияләнә (15-18). Асцитның метаболик мохите шешнең үз мохитеннән аерылып торырга мөмкин, шуңа күрә перитонеаль киңлектә Т күзәнәкләренең яңадан программалашуы ачык түгел. Моннан тыш, шеш мохитендә булган асцит һәм метаболитлар арасындагы төп аермалар һәм гетерогенлык иммун күзәнәкләренең инфильтрациясенә һәм аларның шешләрдәге функциясенә комачауларга мөмкин, һәм алга таба тикшеренүләр кирәк.
Бу проблемаларны чишү өчен, без төрле күзәнәк төрләрен (CD4 + һәм CD8 + T күзәнәкләрен дә кертеп), шулай ук ​​шешләр эчендә һәм алар арасында өйрәнү өчен сизгер күзәнәк аеру һәм сыек хроматография тандем масса-спектрометриясе (LC-MS/MS) ысулын эшләдек. Аның метаболитлары пациентның бер үк асцит һәм шеш мохитендәге күзәнәкләрне үз эченә ала. Без бу ысулны югары үлчәмле агым цитометриясе һәм бер күзәнәкле РНК секвенирлавы (scRNA-seq) белән берлектә кулланабыз, бу төп популяцияләрнең метаболик статусының югары дәрәҗәдә ачыкланган портретын тәкъдим итәбез. Бу ысул шеш Т күзәнәкләрендә 1-метилникотинамид (MNA) дәрәҗәсенең сизелерлек артуын ачыклады, һәм in vitro экспериментлар MNAның Т күзәнәк функциясенә иммуномодулятор йогынтысы элек билгесез булуын күрсәтте. Гомумән алганда, бу ысул шешләр һәм иммун күзәнәкләре арасындагы үзара метаболик үзара бәйләнешләрне ачыклый һәм иммун көйләү метаболитлары турында уникаль мәгълүмат бирә, бу Т күзәнәкләренә нигезләнгән аналык яман шеше иммунотерапиясен дәвалау өчен файдалы булырга мөмкин.
Без глюкоза үзләштерүне бер үк вакытта санлаштыру өчен югары үлчәмле агым цитометриясен кулландык [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) һәм митохондриаль активлык [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) - иммун күзәнәкләрне һәм шеш күзәнәкләре популяцияләрен аеручы типик маркерлар (S2 таблицасы һәм S1A рәсеме). Бу анализ күрсәткәнчә, Т күзәнәкләре белән чагыштырганда, асцит һәм шеш күзәнәкләренең глюкоза үзләштерү дәрәҗәсе югарырак, ләкин митохондриаль активлыкта аермалар азрак. Шеш күзәнәкләренең [CD45-EpCAM (EpCAM)+] уртача глюкоза үзләштерүе Т күзәнәкләренекеннән өч-дүрт тапкыр, ә CD4 + Т күзәнәкләренең уртача глюкоза үзләштерүе CD8 + Т күзәнәкләренекеннән 1,2 тапкыр артыграк, бу шеш инфильтрацияләүче лимфоцитларның (TIL) хәтта бер үк TMEда да төрле метаболик таләпләргә ия булуын күрсәтә (1А рәсем). Киресенчә, шеш күзәнәкләрендәге митохондриаль активлык CD4 + T күзәнәкләренекенә охшаш, һәм ике күзәнәк төренең дә митохондриаль активлыгы CD8 + T күзәнәкләренә караганда югарырак (1B рәсем). Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр метаболик дәрәҗәне күрсәтә. Шеш күзәнәкләренең метаболик активлыгы CD4 + T күзәнәкләренә караганда югарырак, һәм CD4 + T күзәнәкләренең метаболик активлыгы CD8 + T күзәнәкләренә караганда югарырак. Күзәнәк төрләре буенча бу йогынтыларга карамастан, CD4 + һәм CD8 + T күзәнәкләренең метаболик статусында яки аларның асциттагы чагыштырма нисбәтендә шешләр белән чагыштырганда эзлекле аерма юк (1C рәсем). Киресенчә, CD45 күзәнәк фракциясендә шештәге EpCAM+ күзәнәкләренең өлеше асцит белән чагыштырганда арткан (1D рәсем). Шулай ук ​​без EpCAM+ һәм EpCAM- күзәнәк компонентлары арасында ачык метаболик аерманы күзәттек. EpCAM+ (шеш) күзәнәкләрендә EpCAM- күзәнәкләренә караганда глюкозаны үзләштерү һәм митохондриаль активлык югарырак, бу TMEдагы шеш күзәнәкләрендәге фибробластларның метаболик активлыгыннан күпкә югарырак (1, E һәм F рәсем).
(A һәм B) Глюкозаны үзләштерүнең (2-NBDG) уртача флуоресценция интенсивлыгы (MFI) (A) һәм CD4 + T күзәнәкләренең митохондриаль активлыгы (MitoTracker куе кызыл) (B) Асцит һәм шештән алынган CD8 + T күзәнәкләре һәм EpCAM + CD45-шешек күзәнәкләре. (C) Асцит һәм шештә CD4 + һәм CD8 + күзәнәкләренең (CD3 + T күзәнәкләренең) нисбәте. (D) Асцит һәм шештә (CD45−) EpCAM + шеш күзәнәкләренең өлеше. (E һәм F) EpCAM + CD45-шешек һәм EpCAM-CD45-матрица глюкозаны үзләштерү (2-NBDG) (E) һәм митохондриаль активлык (MitoTracker куе кызыл) (F) типик графиклар (сул) һәм типик графиклар (Уң) Асцит һәм шеш күзәнәкләре. (G) Агым цитометриясе ярдәмендә CD25, CD137 һәм PD1 экспрессиясенең типик графиклары. (H һәм I) CD4 + T күзәнәкләрендә (H) һәм CD8 + T күзәнәкләрендә (I) CD25, CD137 һәм PD1 экспрессиясе. (J һәм K) CCR7 һәм CD45RO экспрессиясенә нигезләнгән наив, үзәк хәтер (Tcm), эффектор (Teff) һәм эффектор хәтер (Tem) фенотиплары. Асцит һәм шешләрдә CD4 + T күзәнәкләренең (J) һәм CD8 + T күзәнәкләренең (K) репрезентатив рәсемнәре (сулда) һәм таблица мәгълүматлары (уңда). Парлы t-тест ярдәмендә билгеләнә торган P кыйммәтләре (*P<0.05, **P<0.01 һәм ***P<0.001). Сызык туры килгән пациентларны күрсәтә (n = 6). FMO, флуоресценция минус бер; MFI, флуоресценция интенсивлыгының уртача күрсәткече.
Алга таба анализ югары дәрәҗәдә ачыкланган Т-күзәнәк фенотипик статусы арасындагы башка мөһим аермаларны ачыклады. Шешләрдә активлаштырылган (1 нче рәсем, G дан I га кадәр) һәм эффектор хәтер (1 нче рәсем, J һәм K) асцитларга караганда күпкә ешрак очрый (CD3 + Т күзәнәкләре өлеше). Шулай ук, активлашу маркерлары (CD25 һәм CD137) һәм кимү маркерлары [программалаштырылган күзәнәк үлеме аксымы 1 (PD1)] экспрессиясе буенча фенотипны анализлау бу популяцияләрнең метаболик үзенчәлекләре төрле булса да (S1, B дан E га кадәр), ләкин наив, эффектор яки хәтер төркемнәре арасында метаболик аермалар күзәтелмәгәнлеген күрсәтте (S1, F дан I га кадәр). Бу нәтиҗәләр машина белән өйрәнү ысуллары ярдәмендә күзәнәк фенотипларын автоматик рәвештә билгеләү юлы белән расланды (21), бу пациентның асцитларында күп санлы сөяк мие күзәнәкләренең (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) булуын ачыклады (S2A рәсем). Барлык ачыкланган күзәнәк төрләре арасында бу миелоид күзәнәк популяциясе глюкоза үзләштерүнең иң югары күрсәткечләрен һәм митохондриаль активлыкны күрсәтте (S2 рәсем, B - G). Бу нәтиҗәләр HGSC пациентларында асцит һәм шешләрдә табылган күп күзәнәк төрләре арасындагы көчле метаболик аермаларны күрсәтә.
TIL метабономик үзенчәлекләрен аңлауда төп кыенлык - шешләрдән җитәрлек сафлык, сыйфат һәм күләмдәге Т күзәнәк үрнәкләрен аерып алу зарурлыгы. Соңгы тикшеренүләр күрсәткәнчә, агым цитометриясенә нигезләнгән сортлау һәм бөртекләрне баету ысуллары күзәнәк метаболит профильләрендә үзгәрешләргә китерергә мөмкин (22-24). Бу проблеманы хәл итү өчен, без бөртекләрне баету ысулын LC-MS/MS ярдәмендә анализлау алдыннан хирургик юл белән алынган кеше йомыркалык яман шешеннән TILны аерып алу һәм аеру өчен оптимальләштердек (Материаллар һәм методларны карагыз; 2А рәсем). Бу протоколның метаболит үзгәрешләренә гомуми йогынтысын бәяләү өчен, без югарыдагы бөртекләрне аеру этабыннан соң сәламәт донорлар тарафыннан активлаштырылган Т күзәнәкләренең метаболит профильләрен бөртекләр аерылмаган, ләкин бозда калган күзәнәкләр белән чагыштырдык. Бу сыйфат контроле анализы бу ике шарт арасында югары корреляция булуын (r = 0,77), һәм 86 метаболит төркеменең техник кабатланучанлыгы югары кабатланучанлыкка ия ​​булуын күрсәтте (2B рәсем). Шуңа күрә бу ысуллар күзәнәк тибын баету процессында булган күзәнәкләрдә төгәл метаболит анализын үткәрә ала, шуның белән HGSC'та билгеле метаболитларны ачыклау өчен беренче югары сыйфатлы платформа тәэмин итә, шуның белән кешеләргә күзәнәк спецификасын тирәнтен аңларга мөмкинлек бирә. Җенси метаболизм программасы.
(A) Магнит бөртекләрен баетуның схематик диаграммасы. LC-MS/MS белән анализлау алдыннан, күзәнәкләр магнит бөртекләрен баетуның өч рәттән этабын үткәрәчәк яки бозда калачак. (B) Баету төренең метаболитлар күплегенә йогынтысы. Һәр баету төре өчен өч үлчәүнең уртача күрсәткече ± SE. Соры сызык 1:1 мөнәсәбәтен күрсәтә. Кабатланган үлчәүләрнең класс эчендәге корреляциясе (ICC) күчәр билгесендә күрсәтелгән. NAD, никотинамид аденин динуклеотиды. (C) Пациент метаболитларын анализлау эш процессының схематик диаграммасы. Асцитлар яки шешләр пациентлардан җыела һәм криоконсервацияләнә. Һәр үрнәкнең кечкенә өлеше агым цитометриясе ярдәмендә анализланды, ә калган үрнәкләр CD4+, CD8+ һәм CD45- күзәнәкләре өчен өч тапкыр баету этабыннан үтте. Бу күзәнәк фракцияләре LC-MS/MS ярдәмендә анализланды. (D) Стандартлаштырылган метаболит күплегенең җылылык картасы. Дендрограмма үрнәкләр арасындагы Евклид ераклыкларының Уорд кластерын күрсәтә. (E) Һәр үрнәкнең өч кабатланмасын күрсәтүче үрнәк метаболит картасының төп компонент анализы (PCA), бер үк пациенттан үрнәкләр сызык белән тоташтырылган. (F) Пациентка бәйле үрнәкнең метаболит профиленең PCA (ягъни, өлешчә артыклыкны куллану); үрнәк төре кабарынкы кабык белән чикләнгән. PC1, төп компонент 1; PC2, төп компонент 2.
Аннары без бу баету ысулын алты HGSC пациентының беренчел асцитлары һәм шешләрендәге CD4+, CD8+ һәм CD45-күзәнәк фракцияләрендәге 99 метаболитны анализлау өчен кулландык (2C рәсем, S3A рәсем һәм S3 һәм S4 таблицалары). Кызыксыну популяциясе тере күзәнәкләрнең башлангыч зур үрнәгенең 2% тан 70% ка кадәр өлешен тәшкил итә, һәм күзәнәкләрнең өлеше пациентлар арасында бик нык аерылып тора. Бүртекләрне аерганнан соң, кызыксындыруның баетылган өлеше (CD4+, CD8+ яки CD45-) үрнәктәге барлык тере күзәнәкләрнең уртача 85% тан артыгын тәшкил итә. Бу баету ысулы безгә кеше шеше тукымалары метаболизмыннан күзәнәк популяцияләрен анализларга мөмкинлек бирә, моны зур үрнәкләрдән эшләү мөмкин түгел. Бу протоколны кулланып, без l-кинуренин һәм аденозин, бу ике яхшы характерланган иммуносупрессив метаболитның шеш Т күзәнәкләрендә яки шеш күзәнәкләрендә югары булуын билгеләдек (S3, B һәм C рәсемнәре). Шуңа күрә бу нәтиҗәләр пациент тукымаларында биологик яктан мөһим метаболитларны табу өчен безнең күзәнәк аеру һәм масса-спектрометрия технологиясенең дөреслеген һәм сәләтен күрсәтә.
Безнең анализ шулай ук ​​пациентлар эчендә һәм алар арасында күзәнәк төрләренең нык метаболик аерылуын ачыклады (2D рәсем һәм S4A рәсем). Аерым алганда, башка пациентлар белән чагыштырганда, 70 нче пациент төрле метаболик үзенчәлекләр күрсәтте (2E рәсем һәм S4B рәсем), бу пациентлар арасында метаболик гетерогенлыкның сизелерлек булуын күрсәтә. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, башка пациентлар белән чагыштырганда (1,2 - 2 литр; S1 таблицасы), 70 нче пациентта җыелган асцитның гомуми күләме (80 мл) азрак иде. Төп компонент анализы вакытында пациентлар арасындагы гетерогенлыкны контрольдә тоту (мәсәлән, өлешчә артыклык анализын куллану) күзәнәк төрләре арасында даими үзгәрешләрне күрсәтә, һәм күзәнәк төрләре һәм/яки микротирәлек метаболит профиле буенча ачык рәвештә агрегацияләнгән (2F рәсем). Аерым метаболитларны анализлау бу эффектларны ассызыклады һәм күзәнәк төрләре һәм микротирәлек арасында мөһим аермаларны ачыклады. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, күзәтелгән иң экстремаль аерма - MNA, ул гадәттә CD45-күзәнәкләрдә һәм шешкә инфильтрацияләнгән CD4+ һәм CD8+ күзәнәкләрендә баетылган (3А рәсем). CD4+ күзәнәкләре өчен бу эффект иң ачык күренә, һәм CD8+ күзәнәкләрендәге MNA да әйләнә-тирә мохиттән көчле тәэсирләнә кебек. Ләкин бу мөһим түгел, чөнки алты пациентның өчесендә генә шеш CD8+ баллары бәяләнә ала. MNAдан тыш, асцит һәм шешләрдәге төрле күзәнәкләрдә, TILда начар характерланган башка метаболитлар да төрлечә бай (S3 һәм S4 рәсемнәре). Шуңа күрә бу мәгълүматлар алга таба тикшеренүләр өчен өметле иммуномодулятор метаболитлар җыелмасын ача.
(A) Асцит һәм шештән CD4+, CD8+ һәм CD45- күзәнәкләрендә MNA нормальләштерелгән күләме. Картография графигында медиана (сызык), квартильара диапазон (рамка шарниры) һәм мәгълүмат диапазоны, квартильара диапазоннан (рамка мыегы) 1,5 тапкырга кадәр күрсәтелгән. Пациент материаллары һәм методларында тасвирланганча, P кыйммәтен билгеләү өчен пациентның лимма кыйммәтен кулланыгыз (*P<0,05 һәм **P<0,01). (B) MNA метаболизмының схематик диаграммасы (60). Метаболитлар: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибозасы; NMN, никотинамид мононуклеотиды. Ферментлар (яшел): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуиннар; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансфераза; AOX1, альдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид мононуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) Асцит (соры) һәм шешнең scRNA-sequence t-SNE (кызыл; n = 3 пациент). (D) scRNA-sequence ярдәмендә ачыкланган төрле күзәнәк популяцияләрендә NNMT экспрессиясе. (E) SK-OV-3, кеше эмбриональ бөерендә (HEK) 293T, Т күзәнәкләрендә һәм MNA белән эшкәртелгән Т күзәнәкләрендә NNMT һәм AOX1 экспрессиясе. Катылган экспрессия SK-OV-3 белән чагыштырганда күрсәтелгән. SEM белән экспрессия үрнәге күрсәтелгән (n = 6 сәламәт донор). 35тән югарырак Ct кыйммәтләре ачыкланмый дип санала (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, Т күзәнәкләрендә һәм 8 мМ MNA белән эшкәртелгән Т күзәнәкләрендә SLC22A1 һәм SLC22A2 экспрессиясе. Катылган экспрессия SK-OV-3 белән чагыштырганда күрсәтелгән. SEM белән экспрессия үрнәге күрсәтелгән (n = 6 сәламәт донор). 35тән югарырак Ct кыйммәтләре ачыкланмый дип санала (UD). (G) MNA белән 72 сәгать инкубациядән соң активлаштырылган сәламәт донор Т күзәнәкләрендә күзәнәк MNA күләме. SEM белән экспрессия үрнәге күрсәтелгән (n = 4 сәламәт донор).
MNA метил төркемен S-аденозил-1-метиониннан (SAM) никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; 3B рәсем) ярдәмендә никотинамидка (NA) күчерү юлы белән җитештерелә. NNMT төрле кеше яман шешләрендә артык күп экспрессияләнә һәм пролиферация, инвазия һәм метастаз белән бәйле (25-27). TME'дагы Т-күзәнәкләрендәге MNA чыганагын яхшырак аңлау өчен, без өч HGSC пациентының асцит һәм шешләрендә NNMT экспрессиясен күзәнәк төрләре буенча характерлау өчен scRNA-seq кулландык (S5 таблицасы). Якынча 6500 күзәнәкне анализлау күрсәткәнчә, асцит һәм шеш мохитендә NNMT экспрессиясе фаразланган фибробласт һәм шеш күзәнәк популяцияләре белән чикләнгән (3 нче рәсем, C һәм D). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, PTPRC (CD45 +) экспрессияләүче бернинди популяциядә дә ачык NNMT экспрессиясе юк (3D рәсем һәм S5A рәсем), бу метаболит спектрында ачыкланган MNA'ның Т-күзәнәкләренә кертелгәнлеген күрсәтә. Альдегид оксидаза 1 (AOX1) экспрессиясе MNAны 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамидка (2-PYR) яки 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамидка (4-PYR) әйләндерә; 3B рәсем) шулай ук ​​COL1A1 экспрессияләүче фибробластлар популяциясе белән чикләнгән (S5A рәсем), алар бергәләп Т күзәнәкләренең гадәти MNA метаболизмы сәләтенә ия булмавын күрсәтә. Бу MNA белән бәйле геннарның экспрессия үрнәге HGSC пациентларыннан асцитлардан алынган икенче бәйсез күзәнәк мәгълүматлары җыелмасы ярдәмендә тикшерелде (S5B рәсем; n = 6) (16). Моннан тыш, MNA белән дәваланган сәламәт донор Т күзәнәкләренең санлы полимераз чылбыр реакциясе (qPCR) анализы контроль SK-OV-3 йомыркалык шеше күзәнәкләре белән чагыштырганда, NNMT яки AOX1 экспрессияләнмәгән диярлек булуын күрсәтте (3E рәсем). Бу көтелмәгән нәтиҗәләр MNA фибробластлардан яки шешләрдән TMEдагы күрше Т күзәнәкләренә бүленеп чыгарга мөмкин булуын күрсәтә.
Кандидатлар арасында эри торган ташучы 22 (SLC22) гаиләсе (SLC22A1, SLC22A2 һәм SLC22A3) белән кодланган 1 дән 3 кә кадәр органик катион транспортерлары гаиләсе (OCT1, OCT2 һәм OCT3) булса да, MNA потенциаль транспортерлары әле билгеләнмәгән (28). Сәламәт донор Т күзәнәкләреннән алынган мРНКның QPCR анализы SLC22A1 экспрессиясенең түбән дәрәҗәсен күрсәтте, ләкин SLC22A2 дәрәҗәсен ачыклау мөмкин түгел иде, бу аның әдәбиятта элек хәбәр ителгәнен раслады (3F рәсем) (29). Киресенчә, SK-OV-3 йомыркалык шеш күзәнәк линиясе ике транспортерның да югары дәрәҗәсен күрсәтте (3F рәсем).
Т күзәнәкләренең чит MNAны сеңдерү сәләтенә ия булу мөмкинлеген тикшерү өчен, сәламәт донор Т күзәнәкләре төрле концентрацияле MNA булганда 72 сәгать дәвамында үстерелде. Экзоген MNA булмаганда, MNA күзәнәк эчтәлеген ачыклап булмый (3G рәсем). Ләкин, экзоген MNA белән эшкәртелгән активлаштырылган Т күзәнәкләре күзәнәкләрдә MNA эчтәлегенең дозага бәйле рәвештә артуын күрсәтте, 6 мМ MNA кадәр (3G рәсем). Бу нәтиҗә транспортер экспрессиясенең түбән дәрәҗәсенә һәм күзәнәк эчендәге MNA метаболизмы өчен җаваплы төп фермент җитмәүгә карамастан, TIL MNAны үзләштерә алуын күрсәтә.
Пациентларның Т-күзәнәкләрендәге метаболитлар спектры һәм in vitro MNA абсорбциясе экспериментлары яман шеш белән бәйле фибробластларның (CAF) MNA бүлеп чыгару мөмкинлеген арттыра, һәм шеш күзәнәкләре TIL фенотипын һәм функциясен көйли ала. MNAның Т-күзәнәкләренә йогынтысын билгеләү өчен, сәламәт донор Т-күзәнәкләре in vitro MNA булганда да, булмаганда да активлаштырылды, һәм аларның пролиферациясе һәм цитокин җитештерүе бәяләнде. Иң югары дозада MNA өстәгәннән соң 7 көн үткәч, популяциянең икеләтә артуы уртача кимеде, ә барлык дозаларда да көч сакланды (4А рәсем). Моннан тыш, экзоген MNA белән дәвалау шеш некрозы факторы-α экспрессияләүче CD4+ һәм CD8+ Т-күзәнәкләре өлешенең артуына китерде (TNFα; 4B рәсем). Киресенчә, IFN-γ күзәнәк эчендә җитештерү CD4+ T-күзәнәкләрендә сизелерлек кимеде, ләкин CD8+ T-күзәнәкләрендә түгел, һәм интерлейкин 2дә сизелерлек үзгәреш булмады (IL-2; 4 нче рәсем, C һәм D). Шуңа күрә, бу MNA белән эшкәртелгән Т күзәнәк культураларыннан алынган өслек катламнарның фермент белән бәйләнгән иммуносорбент анализы (ELISA) TNFα күләменең сизелерлек артуын, IFN-γ күләменең кимүен һәм IL-2 күләменең үзгәрмәвен күрсәтте (4 нче рәсем, E - G). . IFN-γ күләменең кимүе MNAның Т күзәнәкләренең шешкә каршы активлыгын тоткарлауда роль уйнарга мөмкинлеген күрсәтә. MNAның Т күзәнәкләренә бәйле цитотоксиклыкка йогынтысын симуляцияләү өчен, сәламәт донор периферик кан мононуклеар күзәнәкләре (PBMC) тарафыннан фолий рецепторы α һәм яшел флуоресцент аксым (GFP) -CAR-T) күзәнәкләре белән көйләнгән CAR-T (GFP) рецепторларына юнәлтелгән химер антиген рецепторы T (FRα-CAR-T) күзәнәкләре җитештерелә. CAR-T күзәнәкләре MNA катнашында 24 сәгать дәвамында үстерелде, аннары эффекторга һәм максатка нисбәтендә 10:1 фолат рецепторы α экспрессияләүче кеше SK-OV-3 йомыркалык шеш күзәнәкләре белән бергә үстерелде. MNA белән дәвалау FRα-CAR-T күзәнәкләренең үтерү активлыгының сизелерлек кимүенә китерде, бу аденозин белән дәваланган FRα-CAR-T күзәнәкләренә охшаш иде (4H рәсем).
(A) 7 нче көнне культурадан турыдан-туры гомуми яшәүчән күзәнәкләр саны һәм популяциянең икеләтә артуы (PD). Баганалы график алты сәламәт донорның уртача + SEM күрсәткечен күрсәтә. Кимендә n = 3 бәйсез экспериментлардан алынган мәгълүматларны күрсәтә. (B - D) CD3/CD28 һәм IL-2 7 көн дәвамында Т күзәнәкләрен үзләренең MNA концентрацияләрендә активлаштыру өчен кулланылды. Анализ алдыннан, күзәнәкләр 4 сәгать дәвамында GolgiStop белән PMA/ионимицин белән стимуллаштырылды. T күзәнәкләрендә TNFα (B) экспрессиясе. Тере күзәнәкләрдә TNFα экспрессиясенең мисал рәсеме (сулда) һәм таблица мәгълүматлары (уңда). T күзәнәкләрендә IFN-γ (C) һәм IL-2 (D) экспрессиясе. Цитокиннар экспрессиясе агым цитометриясе белән үлчәнде. Баганалы график уртача (n = 6 сәламәт донор) + SEM күрсәткечен күрсәтә. P кыйммәтен билгеләү өчен дисперсиянең берьяклы анализын һәм кабатланган үлчәүләрне кулланыгыз (*P<0.05 һәм **P<0.01). Кимендә n = 3 бәйсез экспериментлардан алынган мәгълүматларны күрсәтә. (E дан G га кадәр) CD3/CD28 һәм IL-2 Т күзәнәкләрен үзләренең MNA концентрацияләрендә 7 көн дәвамында активлаштыру өчен кулланылды. Мохит PMA/иониомицин стимуляциясеннән 4 сәгать элек һәм аннан соң җыелды. TNFα (E), IFN-γ (F) һәм IL-2 (G) концентрацияләре ELISA ярдәмендә үлчәнде. Баганалы график уртачаны (n = 5 сәламәт донор) + SEM күрсәтә. P кыйммәте дисперсиянең берьяклы анализы һәм кабатланган үлчәүләр ярдәмендә билгеләнә (*P<0.05). Нокталы сызык ачыклауның ачыклау чиген күрсәтә. (H) Күзәнәк лизисы анализы. FRα-CAR-T яки GFP-CAR-T күзәнәкләре 24 сәгать дәвамында аденозин (250μM) яки MNA (10 mM) белән көйләнде, яки эшкәртелмәде (Ctrl). SK-OV-3 күзәнәкләренең үтерү проценты үлчәнде. P кыйммәте Welch t тесты белән билгеләнде (*P<0.5 һәм **P<0.01).
MNAга бәйле TNFα экспрессиясен көйләүне механик яктан аңлау өчен, MNA белән эшкәртелгән Т күзәнәкләренең TNFα мРНКсындагы үзгәрешләр бәяләнде (5А рәсем). MNA белән эшкәртелгән сәламәт донор Т күзәнәкләрендә TNFα транскрипция дәрәҗәләренең ике тапкыр артуы күзәтелде, бу MNAның TNFα транскрипция көйләүенә бәйле булуын күрсәтә. Бу мөмкин булган көйләү механизмын тикшерү өчен, TNFαны көйләүче ике билгеле транскрипция факторы, атап әйткәндә, активлаштырылган Т күзәнәкләренең ядро ​​факторы (NFAT) һәм специфик аксым 1 (Sp1), MNAның проксималь TNFα промоторына бәйләнешенә җавап итеп бәяләнде (30). TNFα промоторында 6 билгеләнгән NFAT бәйләнеш урыны һәм 2 Sp1 бәйләнеш урыны бар, алар бер урында каплана [5'капкачтан -55 база пары (bp)] (30). Хроматин иммунопреципитациясе (ChIP) MNA белән эшкәртелгәндә, Sp1ның TNFα промоторына бәйләнеше өч тапкыр артканлыгын күрсәтте. NFATның кушылуы да артты һәм әһәмияткә якынлашты (5B рәсем). Бу мәгълүматлар MNA'ның Sp1 транскрипциясе аша TNFα экспрессиясен, һәм азрак дәрәҗәдә NFAT экспрессиясен көйләвен күрсәтә.
(A) MNAсыз үстерелгән Т күзәнәкләре белән чагыштырганда, MNA белән эшкәртелгән Т күзәнәкләрендә TNFα экспрессиясенең катлау үзгәреше. SEM белән экспрессия үрнәге күрсәтелгән (n = 5 сәламәт донор). Кимендә n = 3 бәйсез эксперименттан алынган мәгълүматларны күрсәтә. (B) NFAT һәм Sp1 4 сәгать дәвамында (Ctrl) һәм PMA/иономицин стимуляциясе белән берләштерелгәннән соң, 8 мМ MNA белән яки ансыз эшкәртелгән Т күзәнәкләренең TNFα промоторы. Иммуноглобулин G (IgG) һәм H3 иммунопреципитация өчен тискәре һәм уңай контроль төркемнәр буларак кулланылды. ChIP санлаштыруы MNA белән эшкәртелгән күзәнәкләрдә Sp1 һәм NFAT ның TNFα промоторына бәйләнеше контроль төркем белән чагыштырганда берничә тапкыр артканлыгын күрсәтте. Кимендә n = 3 бәйсез эксперименттан алынган мәгълүматларны күрсәтә. Күп санлы t-тестлар белән билгеләнгән P кыйммәте (*** P <0.01). (C) HGSC асцитлары белән чагыштырганда, Т күзәнәкләре (цитотоксик булмаган) шештә TNF экспрессиясенең артуын күрсәтте. Төсләр төрле пациентларны күрсәтә. Күрсәтелгән күзәнәкләр очраклы рәвештә 300 гә кадәр сайлап алынган һәм артык сызылуны чикләү өчен тибрәнүләр ясалган (** Padj = 0.0076). (D) Йомыркалык яман шеше өчен MNA моделе тәкъдим ителә. MNA TME'дагы шеш күзәнәкләрендә һәм фибробластларда җитештерелә һәм Т күзәнәкләре тарафыннан үзләштерелә. MNA Sp1'ның TNFα промоторына бәйләнешен арттыра, бу TNFα транскрипциясенең һәм TNFα цитокиннары җитештерүенең артуына китерә. MNA шулай ук ​​IFN-γ кимүенә китерә. Т күзәнәк функциясенең тоткарлануы үтерү сәләтенең кимүенә һәм шеш үсешенең тизләнүенә китерә.
Хәбәрләргә караганда, TNFα алгы һәм арткы яктан бәйле шешкә каршы һәм шешкә каршы эффектларга ия, ләкин ул аналык яман шешенең үсешен һәм метастазын стимуллаштыруда билгеле роль уйный (31-33). Хәбәрләргә караганда, аналык яман шеше белән авыручыларда асцит һәм шеш тукымаларында TNFα концентрациясе яман шеш тукымаларына караганда югарырак (34-36). Механизм ягыннан, TNFα лейкоцитларның активлашуын, функциясен һәм пролиферациясен көйли ала, һәм яман шеш күзәнәкләренең фенотипын үзгәртә ала (37, 38). Бу нәтиҗәләргә туры китереп, дифференциаль ген экспрессиясе анализы күрсәткәнчә, асцит белән чагыштырганда, шеш тукымаларында Т күзәнәкләрендә TNF сизелерлек югарырак көйләнгән (5C рәсем). TNF экспрессиясенең артуы бары тик цитотоксик булмаган фенотиплы Т күзәнәк популяцияләрендә генә күренде (S5A рәсем). Кыскасы, бу мәгълүматлар MNAның HGSCда икеләтә иммуносупрессив һәм шешне стимуллаштыручы эффектлары бар дигән карашны раслый.
Агым цитометриясенә нигезләнгән флуоресцент маркировкалау TIL метаболизмын өйрәнүнең төп ысулына әйләнде. Бу тикшеренүләр күрсәткәнчә, периферик кан лимфоцитлары яки икенчел лимфоид органнардан алынган Т-күзәнәкләр белән чагыштырганда, тычкан һәм кеше TIL глюкозаны үзләштерүгә югарырак омтылышка ия ​​(4, 39) һәм митохондриаль функциянең әкренләп югалуына китерә (19, 40). Бу тикшеренүдә охшаш нәтиҗәләр күзәтсәк тә, төп үсеш - шеш күзәнәкләре метаболизмын һәм шул ук резекцияләнгән шеш тукымасыннан алынган TILны чагыштыру. Бу алдагы отчетларның кайберләре белән туры китереп, асцит һәм шешләрдән алынган шеш (CD45-EpCAM +) күзәнәкләре CD8 + һәм CD4 + T күзәнәкләренә караганда глюкозаны югарырак үзләштерә, бу шеш күзәнәкләренең югары глюкоза үзләштерүен Т күзәнәкләре белән чагыштырырга мөмкин булуын раслый. Т-күзәнәкләр көндәшлеге концепциясе. TME. Ләкин, шеш күзәнәкләренең митохондриаль активлыгы CD8 + T күзәнәкләренә караганда югарырак, ләкин митохондриаль активлык CD4 + T күзәнәкләренә охшаш. Бу нәтиҗәләр оксидлашу метаболизмы шеш күзәнәкләре өчен мөһим дигән яңа теманы ныгыта (41, 42). Алар шулай ук ​​CD8 + T күзәнәкләре CD4 + T күзәнәкләренә караганда оксидлашу дисфункциясенә күбрәк бирешүчән булырга мөмкин, яки CD4 + T күзәнәкләре митохондриаль активлыкны саклап калу өчен глюкозадан тыш башка углерод чыганакларын кулланырга мөмкин дип фаразлыйлар (43, 44). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, без асцитта CD4 + T эффекторлары, Т эффектор хәтере һәм Т үзәк хәтер күзәнәкләре арасында глюкозаны үзләштерүдә яки митохондриаль активлыкта бернинди аерма күзәтмәдек. Шулай ук, шешләрдә CD8 + T күзәнәкләренең дифференциация торышы глюкозаны үзләштерүдәге үзгәрешләр белән бернинди дә бәйләнеше юк, бу in vitro культурасында үстерелгән Т күзәнәкләре һәм in vivo кеше TIL арасындагы мөһим аерманы күрсәтә (22). Бу күзәтүләр шулай ук ​​​​объектив автоматик күзәнәк популяциясен бүлү белән расланды, бу шулай ук ​​​​шешә күзәнәкләренә караганда глюкозаны үзләштерү һәм митохондриаль активлык югарырак булган CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + күзәнәкләренең киң таралганлыгын, ләкин метаболик актив күзәнәк популяциясенә ия булуын күрсәтте. Бу популяция scRNA-seq анализында билгеләнгән миелоид супрессор күзәнәкләренең яки ​​плазмацитоид дендрит күзәнәкләренең фаразланган субпопуляциясен күрсәтергә мөмкин. Бу икесе дә кеше йомыркалыгы шешләрендә теркәлгән булса да [45], алар әле дә бу миелоид субпопуляциясен тасвирлау өчен өстәмә эш кирәк.
Агым цитометриясенә нигезләнгән ысуллар күзәнәк төрләре арасында глюкоза һәм оксидлашу метаболизмындагы гомуми аермаларны ачыклый алса да, TME'да митохондриаль метаболизм өчен глюкоза яки башка углерод чыганаклары тарафыннан җитештерелгән төгәл метаболитлар әлегә билгеләнмәгән. Метаболитларның булуын яки булмавын билгеле бер TIL төркеменә билгеләү өчен, күзәнәк популяциясен кисеп алынган тукымалардан чистарту кирәк. Шуңа күрә, безнең күзәнәкне баету ысулы масса-спектрометрия белән берләштерелгән пациент үрнәкләрендә Т күзәнәкләрендә һәм шеш күзәнәк популяцияләрендә төрлечә баетылган метаболитлар турында мәгълүмат бирә ала. Бу ысулның флуоресценция белән активлаштырылган күзәнәкләрне сортлауга караганда өстенлекләре булса да, кайбер метаболит китапханәләренә табигый тотрыклылык һәм/яки тиз әйләнеш тизлеге аркасында тәэсир итәргә мөмкин (22). Шуңа да карамастан, безнең ысул ике танылган иммуносупрессив метаболитны, аденозин һәм кинуренинны ачыклый алды, чөнки алар үрнәк төрләре арасында бик нык аерылып торалар.
Шешләрнең һәм TIL субтипларының метабономик анализы аналыкның TME'сында метаболитларның ролен тирәнрәк аңларга мөмкинлек бирә. Беренчедән, агым цитометриясен кулланып, без шешләр һәм CD4 + T күзәнәкләре арасында митохондриаль активлыкта аерма юклыгын ачыкладык. Ләкин, LC-MS/MS анализы бу популяцияләр арасында метаболитлар күплегендә сизелерлек үзгәрешләрне күрсәтте, бу TIL метаболизмы һәм аның гомуми метаболик активлыгы турындагы нәтиҗәләрне җентекләп аңлатырга кирәклеген күрсәтә. Икенчедән, MNA - асцитта CD45-күзәнәкләре һәм Т күзәнәкләре арасында иң зур аерма булган метаболит, шешләрдә түгел. Шуңа күрә, бүлекләргә бүленү һәм шеш урнашуы TIL метаболизмына төрле йогынты ясарга мөмкин, бу билгеле бер микротирәлектәге мөмкин булган гетерогенлыкны күрсәтә. Өченчедән, MNA җитештерүче NNMT ферментының экспрессиясе, нигездә, CAF белән чикләнә, ул азрак дәрәҗәдә шеш күзәнәкләре, ләкин шештән алынган Т күзәнәкләрендә ачыкланучы MNA дәрәҗәләре күзәтелә. Аналыкның CAF'ында NNMT'ның артык экспрессиясе билгеле яман шешне стимуллаштыручы эффектка ия, өлешчә CAF метаболизмын, шеш инвазиясен һәм метастазны стимуллаштыру аркасында (27). TIL гомуми дәрәҗәсе уртача булса да, CAF'та NNMT экспрессиясе яман шеш геномы атласы (TCGA) мезенхималь төре белән тыгыз бәйләнгән, бу начар фараз белән бәйле (27, 46, 47). Ниһаять, MNA деградациясе өчен җаваплы AOX1 ферментының экспрессиясе дә CAF популяциясе белән чикләнгән, бу Т күзәнәкләренең MNA метаболизмына сәләтсезлеген күрсәтә. Бу нәтиҗәләр бу ачышны тикшерү өчен өстәмә эшләр кирәк булса да, Т күзәнәкләрендә MNA югары дәрәҗәсе иммуносупрессив CAF микротирәлеге булуын күрсәтергә мөмкин дигән фикерне раслый.
MNA транспортерларының түбән экспрессия дәрәҗәсен һәм MNA метаболизмында катнашучы төп аксымнарның ачыкланмый торган дәрәҗәсен исәпкә алганда, Т күзәнәкләрендә MNA булуы көтелмәгән хәл. NNMT да, AOX1 да scRNA-seq анализы һәм ике бәйсез когортаның максатчан qPCR ярдәмендә ачыклана алмады. Бу нәтиҗәләр MNAның Т күзәнәкләре тарафыннан синтезланмавын, ә тирә-юньдәге TME'дан сеңүен күрсәтә. In vitro экспериментлары Т күзәнәкләренең экзоген MNA туплауга омтылуын күрсәтә.
Безнең in vitro тикшеренүләр күрсәткәнчә, экзоген MNA Т күзәнәкләрендә TNFα экспрессиясен стимуллаштыра һәм Sp1ның TNFα промоторына бәйләнешен көчәйтә. TNFα шешкә каршы һәм шешкә каршы функцияләргә ия булса да, аналык яман шешендә TNFα аналык яман шешенең үсешенә ярдәм итә ала (31-33). Аналык шеше күзәнәк культурасында TNFα нейтральләштерү яки тычкан модельләрендә TNFα сигналын бетерү TNFα аша ялкынсыну цитокиннары җитештерүне яхшырта һәм шеш үсешен тоткарлый ала (32, 35). Шуңа күрә, бу очракта, TME-дан алынган MNA аутокрин элмәге аша TNFα-га бәйле механизм аша ялкынсынуны прометаболит буларак эш итә ала, шуның белән аналык яман шешенең барлыкка килүен һәм таралуын стимуллаштыра (31). Бу мөмкинлеккә нигезләнеп, TNFα блокадасы аналык яман шешен дәвалау өчен потенциаль агент буларак өйрәнелә (37, 48, 49). Моннан тыш, MNA CAR-T күзәнәкләренең аналык шеше күзәнәкләренә цитотоксик тәэсирен боза, MNA аша иммун супрессия өчен өстәмә дәлилләр бирә. Бу нәтиҗәләр бергәләп шешләр һәм CAF күзәнәкләре MNAны тышкы TMEга бүлеп чыгара торган модельне күрсәтә. (i) TNF китереп чыгарган аналык яман шеше үсешен стимуллаштыру һәм (ii) MNA китереп чыгарган T күзәнәкләренең цитотоксик активлыгын ингибирлау аша, бу икеләтә шеш эффектына китерергә мөмкин (5D рәсем).
Нәтиҗә ясап шуны әйтергә мөмкин: тиз күзәнәкләрне баету, бер күзәнәкле секвенирлау һәм метаболик профильләү комбинациясен кулланып, бу тикшеренү HGSC пациентларында шешләр һәм асцит күзәнәкләре арасында зур иммунометаболомик аермаларны ачыклады. Бу комплекслы анализ Т күзәнәкләре арасында глюкозаны үзләштерүдә һәм митохондриаль активлыкта аермалар булуын күрсәтте һәм MNAны күзәнәксез автоном иммун көйләүче метаболит буларак ачыклады. Бу мәгълүматлар TMEның кеше яман шешләрендә Т күзәнәкләре метаболизмына ничек тәэсир итүенә йогынты ясый. Т күзәнәкләре һәм яман шеш күзәнәкләре арасында туклыклы матдәләр өчен турыдан-туры көндәшлек турында хәбәр ителсә дә, метаболитлар шулай ук ​​​​шишек үсешен стимуллаштыру һәм, мөгаен, эндоген иммун җавапларны бастыру өчен туры булмаган көйләүчеләр булып та эшли ала. Бу көйләүче метаболитларның функциональ ролен тулырак тасвирлау шешкә каршы иммун җавапны көчәйтү өчен альтернатив стратегияләр ачарга мөмкин.
Пациент үрнәкләре һәм клиник мәгълүматлар Канада Тукымалар Репозиториясе Челтәре тарафыннан сертификацияләнгән Британ Колумбиясе яман шеше тукымалары репозиторийы аша алынды. Британ Колумбиясе яман шеш тикшеренүләре этика комитеты һәм Британия Колумбиясе Университеты (H07-00463) тарафыннан расланган протокол нигезендә, барлык пациентларның үрнәкләре һәм клиник мәгълүматлары язмача ризалык алдылар яки рәсми рәвештә ризалыкларыннан баш тарттылар. Үрнәкләр сертификатланган BioBankта (BRC-00290) саклана. Пациентның җентекле характеристикасы S1 һәм S5 таблицаларында күрсәтелгән. Криоконсервация өчен, пациентның шеш үрнәген механик рәвештә таркату өчен скальпель кулланыла, аннары аны 100 микронлы фильтр аша этеп, бер күзәнәкле суспензия алалар. Пациентның асцитлары 4°C температурада 1500 әйләнү/мин тизлегендә 10 минут дәвамында центрифугаланды, күзәнәкләрне бөртекләү һәм өслек катламын алу өчен. Шеш һәм асциттан алынган күзәнәкләр 50% җылылык белән инактивлаштырылган кеше AB сывороткасында (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) һәм 10% диметилсульфоксидта криоконсервацияләнде. Бу сакланган бер күзәнәкле суспензияләр эретелде һәм түбәндә тасвирланган метаболомика һәм метаболитларны билгеләү өчен кулланылды.
Тулы мохит 0,22 мкм фильтрланган 50:50 өстәмәле RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific), 10% җылылык белән инактивлаштырылган кеше AB сывороткасы (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific), 1 пенициллин стрептомицин (PenStrep) эремәсе (Thermo Fisher Scientific) һәм 50 мкМ-меркаптоэтанол белән тулыландырылган. AimV (Invitrogen) 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) һәм 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific) белән тулыландырылган. Агым цитометрын буяу буферы 3% җылылык белән инактивлаштырылган AB кеше сывороткасы (Sigma) белән тулыландырылган 0,22 мкм фильтрланган фосфат буферланган тоз эремәсеннән (PBS; Invitrogen) торган. Күзәнәкләрне баету буферы 0,22 мкм фильтрланган PBSтан тора һәм 0,5% җылылык белән инактивлаштырылган кеше AB сывороткасы (Sigma-Aldrich) белән тулыландырылган.
37°C тулы мохиттә күзәнәкләр 10 нМ MT DR һәм 100 μM 2-NBDG белән 30 минут буялды. Аннары күзәнәкләр 4°C температурада 15 минут eF506 яшәүчәнлек буявы белән буялды. Күзәнәкләрне FC Block (eBioscience) һәм Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) буяуларында кабат эретегез, агым цитометры буяу буферында суюлтыгыз (җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп) һәм бүлмә температурасында 10 минут инкубацияләгез. Күзәнәкләрне агым цитометры буяу буферында 4°C температурада 20 минут антитәнчекләр җыелмасы белән буягыз (S2 таблицасы). Анализ алдыннан күзәнәкләрне агым цитометрия буяу буферында (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясе) кабат эретегез. Күзәнәкләр саны мәгълүматларын анализлау өчен SpectroFlo һәм FlowJo V10 кулланыгыз, ә мәгълүматларны булдыру өчен GraphPad Prism 8 кулланыгыз. 2-NBDG һәм MT DR өчен уртача флуоресценция интенсивлыгы (MFI) логарифмик нормальләштерелде, аннары туры килгән пациентларны исәпкә алу өчен статистик анализ өчен парлы t-тест кулланылды. Анализдан 40тан кимрәк вакыйга булган барлык популяцияләрне чыгарыгыз; статистик анализ һәм мәгълүматларны визуализацияләү алдыннан теләсә нинди тискәре кыйммәтләр өчен 1 MFI кыйммәтен кертегез.
Югарыдагы процесс панеленең кул белән каплау стратегиясен тулыландыру өчен, без FlowJo'да үлгән күзәнәкләрне бетергәннән соң, күзәнәкләрне популяциягә автоматик рәвештә билгеләү өчен форма чикләү агачы (FAUST) (21) аша тулы аннотацияне кулландык. Без дөрес урнашмаган кебек күренгән (PD1+ белән PD1-шеш күзәнәкләрен берләштереп) һәм сакланган популяцияләрне берләштерү өчен чыгышны кул белән идарә итәбез. Һәр үрнәктә уртача 2% тан артык күзәнәк бар, барлыгы 11 популяция.
PBMCны лейкоцитларны аеру продуктларыннан аеру өчен фиколл градиент тыгызлыгы центрифугасы кулланылды (STEMCELL Technologies). CD8 + T күзәнәкләре PBMCдан CD8 MicroBeads (Miltenyi) кулланып аерылды һәм җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, 2 атна дәвамында TransAct (Miltenyi) кулланып тулы мохиттә киңәйтелде. Күзәнәкләргә IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) булган тулы мохиттә 5 көн тотарга рөхсәт ителде, аннары TransAct белән кабат стимуллаштырылды. 7 нче көнне, җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, күзәнәкләрне өч рәттән баету өчен кеше CD45 MicroBeads (Miltenyi) кулланылды. Күзәнәкләр агым цитометриясе анализы өчен (югарыда тасвирланганча) бүленде, һәм бер миллион күзәнәк LC-MS/MS анализы өчен өч тапкыр бүленде. Үрнәкләр түбәндә тасвирланганча LC-MS/MS ярдәмендә эшкәртелде. Без югалган метаболит кыйммәтен 1000 ион саны белән бәяләдек. Һәр үрнәк гомуми ион саны (TIC) белән нормальләштерелә, логарифмик рәвештә үзгәртелә һәм анализ алдыннан MetaboAnalystR программасында автоматик рәвештә нормальләштерелә.
Һәр пациентның бер күзәнәкле суспензиясе эретелде һәм 40 мкм фильтр аша тулы мохиткә фильтрланды (югарыда тасвирланганча). Җитештерүче протоколы буенча, CD8+, CD4+ һәм CD45-күзәнәкләре өчен үрнәкләрне (бозда) баету өчен MicroBeads (Miltenyi) кулланып магнит бөртекләрен аеру юлы белән өч рәттән уңай сайлау раунды кулланылды. Кыскасы, күзәнәкләр күзәнәкләрне баету буферында кабат суспензияләнә (югарыда тасвирланганча) һәм санала. Күзәнәкләр кеше CD8 бөртекләре, кеше CD4 бөртекләре яки кеше CD45 бөртекләре (Miltenyi) белән 4°C температурада 15 минут инкубацияләнде, аннары күзәнәкләрне баету буферы белән юылды. Үрнәк LS колонкасы (Miltenyi) аша үткәрелә, һәм уңай һәм тискәре фракцияләр җыела. Озынлыкны киметү һәм күзәнәкләрне торгызу этабын максимальләштерү өчен, аннары CD8-фракциясе CD4+ баетуның икенче раунды өчен кулланыла, ә CD4-фракциясе аннан соңгы CD45 баету өчен кулланыла. Аеру процессы дәвамында эремәне бозда тотыгыз.
Метаболит анализы өчен үрнәкләр әзерләү өчен, күзәнәкләр бер тапкыр бозлы тоз эремәсе белән юылды, һәм һәр үрнәккә 1 мл 80% метанол өстәлде, аннары вортексланды һәм сыек азотта туңдырылды. Үрнәкләр өч туңдыру-эретү циклына дучар ителде һәм 4°C температурада 15 минут дәвамында 14000 әйләнү/мин тизлегендә центрифугаланды. Метаболитларны үз эченә алган өслек катламы кипкәнче парга әйләндерелде. Метаболитлар 50 мкл 0,03% кубыз кислотасында яңадан эретелде, катнаштыру өчен вортексланды, аннары калдыкларны бетерү өчен центрифугаланды.
Метаболитларны югарыда тасвирланганча аерып алыгыз. Метаболомика тикшеренүләре өчен өслек катламын югары нәтиҗәле сыек хроматография шешәсенә күчерегез. Партия эффектларын булдырмас өчен, һәр үрнәкне охшаш сандагы күзәнәкләр белән эшкәртү өчен очраклы эшкәртү протоколын кулланыгыз. Без AB SCIEX QTRAP 5500 Өчле Квадруполь Масса-Спектрометрында (50) элек бастырылган глобаль метаболитларның сыйфат бәяләмәсен үткәрдек. Хроматографик анализ һәм пик мәйданын интеграцияләү MultiQuant 2.1 версиясе программасы (Applied Biosystems SCIEX) ярдәмендә башкарылды.
Югалган метаболит кыйммәтен бәяләү өчен 1000 ион саны кулланылды, һәм һәр үрнәкнең TICсы һәр ачыкланган метаболитның нормальләштерелгән пик мәйданын исәпләү өчен кулланылды, бу үрнәк эшкәртүдән инструменталь анализ ярдәмендә кертелгән үзгәрешләрне төзәтергә мөмкинлек бирде. TIC нормальләштерелгәннән соң, логарифмик конверсия һәм автоматик норма сызыгы масштаблау өчен MetaboAnalystR(51) (гадәти параметр) кулланыла. Без үрнәк төрләре арасындагы метаболом аермаларын тикшерү анализын үткәрү өчен веган R пакеты белән PCA кулландык, һәм пациентларны анализлау өчен өлешчә артыклык анализын кулландык. Үрнәкләр арасындагы Евклид арасын кластерлаштыру өчен җылылык картасы дендрограммасын төзү өчен Уорд ысулын кулланыгыз. Без бөтен күзәнәк төре һәм микротирәлек буенча төрлечә мул метаболитларны ачыклау өчен стандартлаштырылган метаболит муллыгы буенча limma (52) кулландык. Аңлатманы гадиләштерү өчен, без модельне билгеләү өчен төркем уртача параметрын кулланабыз һәм микротирәлектәге күзәнәк төрләрен һәр төркем буларак карыйбыз (n = 6 төркем); әһәмиятлелек тесты өчен без һәр метаболит өчен өч тапкыр үлчәү үткәрдек. Ялган репликациядән качу өчен, пациент лимма дизайнында киртә буларак кертелде. Төрле пациентлар арасындагы метаболитлар аермаларын тикшерү өчен, без пациентларны да кертеп, лимма моделен билгеле бер ысул белән көйләдек. Без күзәнәк тибы һәм Padj <0.05 микротирәлеге арасындагы алдан билгеләнгән контрастның әһәмиятен хәбәр итәбез (Бенджамини-Хохберг төзәтмәсе).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% яшәүчәнлек) ярдәмендә көч белән баетылганнан соң, 10x 5'ген экспрессиясе протоколы ярдәмендә гомуми тере туңдырылган асцит һәм шеш үрнәкләрендә бер күзәнәкле транскриптом секвенирлавы үткәрелде. Бер үк шеш һәм асцит белән биш очрак анализланды, гәрчә бер шеш үрнәгеннән түбән яшәүчәнлек аны кертүгә комачаулады. Пациентларны берничә сайлауга ирешү өчен, без һәр пациентның үрнәкләрен 10x хром контроллеры юлларында берләштердек һәм асцит һәм шеш урыннарын аерым анализладык. Секвенирлавыннан соң [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp парлы оч (PE), Квебек геномы; Шеш һәм асцит өчен күзәнәккә уртача 73,488 һәм 41,378 уку]], без CellSNP һәм Vireo (53) кулландык (CellSNP нигезендә). GRCh38 тарафыннан бирелгән гади кеше SNP (VCF) донор идентификациясенә билгеләнә. Без пациентның генотип статусының (IBS) иң якын идентификациясен (IBS) билгеләү өчен SNPRelate кулланабыз, билгеләнмәгән күзәнәкләрне һәм дуплекслар буларак билгеләнгән күзәнәкләрне һәм асцит һәм шеш үрнәкләре арасында донорларны туры китермичә (54). Бу бурыч нигезендә, без шеш һәм асцитта күзәнәкнең күп булуы белән өч очракны анализлау өчен саклап калдык. Скатерда (55) һәм скранда (56) BioConductor төргәгендә масса фильтрация этабын башкарганнан соң, анализ өчен 6975 күзәнәк (шеш һәм асциттан 2792 һәм 4183 күзәнәк) чыкты. Без Jaccard ераклыгына нигезләнгән уртак якын күрше челтәренең (SNN) igraph'ның (57) Louvain кластерлаштыруын кулланабыз. экспрессия буенча кластер күзәнәкләре. Кластерлар маркер ген экспрессиясенә нигезләнгән фаразланган күзәнәк төрләре белән кул белән аңлатылды һәм t-SNE белән күрсәтелде. Цитотоксик Т күзәнәкләре CD8A һәм GZMA экспрессиясе белән билгеләнә, рибосомаль аксым экспрессиясе түбән булган субкластерларны исәпкә алмаганда. Без Изар һ.б. (16) тарафыннан бастырылган мәгълүматларга мөрәҗәгать иттек, аларның t-SNE урнаштыруын да кертеп, иммун күзәнәк маркерлары һәм NNMT экспрессиясе арасындагы экспрессиянең кабатлануын контрольдә тота ала.
PBMC лейкоцитларны аеру продуктларыннан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тыгызлык центрифугасы ярдәмендә аерылды. CD3 + күзәнәкләре PBMCдан CD3 бөртекләре (Miltenyi) ярдәмендә аерылды. MNA булганда яки булмаганда, CD3 + күзәнәкләре пластинага бәйләнгән CD3 (5 мкг/мл), эри торган CD28 (3 мкг/мл) һәм IL-2 (300 U/мл; Пролейкин) белән активлаштырылды. Киңәйтүнең соңгы көнендә яшәүчәнлек (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) һәм пролиферация (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) агым цитометриясе ярдәмендә бәяләнде. Эффектор функциясен GolgiStop белән PMA (20 нг/мл) һәм ионимицин (1 мкг/мл) белән күзәнәкләрне 4 сәгать дәвамында стимуллаштыру юлы белән бәяләгез, һәм CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) һәм TNFα-флуоресцеин изотиоцианатын (FITC) (MAb11, BD) күзәтегез. 4 сәгать дәвамында qPCR һәм ChIP күзәнәкләрен PMA (20 нг/мл) һәм ионимицин (1 мкг/мл) белән стимуллаштырыгыз. ELISA өслеге 4 сәгать дәвамында PMA (20 нг/мл) һәм ионимицин (1 мкг/мл) белән стимуллаштыру алдыннан һәм аннан соң җыелды.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) кулланып, РНКны аерып алу өчен җитештерүченең протоколын үтәгез. Үрнәкне гомогенлаштыру өчен QIAshredder (QIAGEN) кулланыгыз. Комплементар ДНК (cDNA) синтезлау өчен югары сыйдырышлы РНКны кДНКга әйләндерү комплектын (Thermo Fisher Scientific) кулланыгыз. Ген экспрессиясен санлаштыру өчен (җитештерүченең протоколы буенча) түбәндәге зондлар белән TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) кулланыгыз: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [гидрогенсыз глицералдегид-3-фосфат (GAPDH)] һәм Hs01010726_m1 (SLC22A2). Үрнәкләр MicroAmp оптик пленкасы белән MicroAmp тиз оптик 96 коелы реакция пластинасында (Applied Biosystems) StepOnePlus реаль вакытлы ПЦР системасында (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) эшләтелде. 35 тан арткан теләсә нинди Ct кыйммәте ачыклау чигеннән югарырак дип санала һәм ачыкланмый дип билгеләнә.
Элегрәк тасвирланганча ChIP үткәрегез (58). Кыскасы, күзәнәкләр формальдегид белән эшкәртелде (соңгы концентрациясе 1,42%) һәм бүлмә температурасында 10 минут инкубацияләнде. Өстәмә шешенү буферын (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl һәм 0,1% NP-40) бозда 10 минутка кулланыгыз, аннары тасвирланганча иммунопреципитация буферында кабат эретегез (58). Аннары үрнәк түбәндәге цикллар белән ультратавыш белән эшкәртелде: 10 цикл (20 1 секундлык импульс) һәм 40 секундлык статик вакыт. ChIP дәрәҗәсендәге иммуноглобулин G (күзәнәк сигнализациясе технологиясе; 1 мкл), гистон H3 (күзәнәк сигнализациясе технологиясе; 3 мкл), NFAT (Invitrogen; 3 мкл) һәм SP1 (күзәнәк сигнализациясе технологиясе; 3 мкл) антитәнчекләрен үрнәкне 4°CC температурада төнлә селкетеп инкубацияләгез. А аксымы бөртекләрен (Thermo Fisher Scientific) үрнәк белән 4°C температурада 1 сәгать дәвамында йомшак селкетеп инкубацияләгез, аннары ДНКны баету өчен хелекс бөртекләрен (Bio-Rad) кулланыгыз, ә аксым эшкәртү өчен протеиназа K (Thermo Fisher) кулланыгыз. ПЦР ярдәмендә TNFα промоторы ачыкланды: алга, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; киресенчә, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp продукт). Рәсемнәр Image Lab (Bio-Rad) тарафыннан эшләнгән һәм ImageJ программасы ярдәмендә санланган.
Күзәнәк культурасы өслеге югарыда тасвирланганча җыелды. Билгеләү кеше TNFα ELISA комплекты (Invitrogen), кеше IL-2 ELISA комплекты (Invitrogen) һәм кеше IFN-γ ELISA комплекты (Abcam) җитештерүче процедураларына туры китереп башкарылды. Җитештерүче протоколы буенча, өслек матдәсе TNFα һәм IL-2 ны ачыклау өчен 1:100 нисбәтендә, ә IFN-γ ны ачыклау өчен 1:3 нисбәтендә сыекландырылды. 450 нм да абсорбцияне үлчәү өчен EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) кулланыгыз.
ПБМК лейкоцитларны аеру продуктларыннан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тыгызлык центрифугасы ярдәмендә аерылды. CD3 + күзәнәкләре ПБМКдан CD3 бөртекләре (Miltenyi) ярдәмендә аерылды. MNA булганда яки булмаганда, CD3 + күзәнәкләре пластинага бәйләнгән CD3 (5 мкг/мл), эри торган CD28 (3 мкг/мл) һәм IL-2 (300 U/мл; Пролейкин) белән 3 көн дәвамында активлаштырылды. 3 көннән соң күзәнәкләр җыелды һәм 0,9% лы тозлы эремә белән юылды, ә гранула туңдырылды. Күзәнәкләрне санау 123count eBeads кулланып агым цитометриясе (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясе) ярдәмендә башкарылды.
Метаболитларны югарыда тасвирланганча чыгарыгыз. Киптерелгән экстракт 4000 күзәнәк эквиваленты/мкл концентрациясендә торгызылды. Үрнәкне кире фазалы хроматография (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) һәм CORTECS T3 колонкасы (2.1 × 150 мм, кисәкчәләр зурлыгы 1.6 мкм, мәса зурлыгы 120 Å; #186008500, Waters) ярдәмендә анализлагыз. Поляр масса-спектрометр (6470, Agilent), анда электроспрей ионизациясе уңай режимда эшли. А хәрәкәтчән фазасы 0.1% кумырска кислотасыннан (H2Oда), В хәрәкәтчән фазасы 90% ацетонитрилдан, 0.1% кумырска кислотасыннан тора. LC градиенты 100% A өчен 0 дән 2 минутка кадәр, 99% B өчен 2 дән 7,1 минутка кадәр һәм 99% B өчен 7,1 дән 8 минутка кадәр. Аннары колонканы 3 минут дәвамында 0,6 мл/мин агым тизлегендә хәрәкәтчән А фазасы белән яңадан тигезләгез. Агым тизлеге 0,4 мл/мин тәшкил итә, һәм колонна камерасы 50°C кадәр җылытыла. Тоту вакытын (RT) һәм трансформацияне (RT = 0,882 минут, 1 трансформация = 137→94,1, 2 трансформация = 137→92, 3 трансформация = 137→78) билгеләү өчен MNA'ның саф химик стандартын (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) кулланыгыз. Өч күчү дә дөрес тоту вакытында булганда, спецификлыкны тәэмин итү өчен санлаштыру өчен 1 күчү кулланыла. MNA (Toronto Research Chemical Company) стандарт сызыгы 0,1, 1,0, 10 һәм 100 нг/мл һәм 1,0 һәм 10 мкг/мл сыеклык стандартларын алу өчен төп эремәнең (1 мг/мл) алты серияле суюлтылуы белән булдырылды. Ачыклау чиге 1 нг/мл, ә сызыкча җавап 10 нг/мл һәм 10 мкг/мл арасында. LC/MS анализы өчен ике микролитр үрнәк һәм стандартның һәр инъекциясе кулланыла, һәм анализ платформасының тотрыклылыгын тәэмин итү өчен һәр сигез инъекциядә катнаш сыйфат контроле үрнәге үткәрелә. MNA белән эшкәртелгән барлык күзәнәк үрнәкләренең MNA җаваплары анализның сызыкча диапазонында булды. Мәгълүматлар анализы MassHunter санлы анализ программасы (v9.0, Agilent) ярдәмендә башкарылды.
Икенче буын αFR-CAR конструкциясе Song һ.б. (59) материалыннан алынган. Кыскасы, конструкция түбәндәге эчтәлекне үз эченә ала: CD8a лидер эзлеклелеге, кеше αFR-га хас бер чылбырлы үзгәрүчән фрагмент, CD8a шарнир һәм трансмембран өлкәсе, CD27 күзәнәк эчендәге домен һәм CD3z күзәнәк эчендәге домен. Тулы CAR эзлеклелеге GenScript ярдәмендә синтезланган, аннары трансдукция нәтиҗәлелеген бәяләү өчен кулланылган GFP экспрессия кассетасының өске агымында икенче буын лентивирус экспрессия векторына клонлаштырылган.
Лентивирус HEK293T күзәнәкләрен трансфекцияләү юлы белән җитештерелә [Америка тибындагы культуралар коллекциясе (ATCC); 10% феталь сыер сывороткасы (FBS) һәм 1% PenStrep булган Дульбекконың модификацияләнгән Eagle мохитендә үстерелә, CAR-GFP векторы кулланыла һәм төргәк плазмидларында (psPAX2 һәм pMD2.G, Addgene) липофекция амины (Sigma-Aldrich) кулланыла. Вируслы өслек трансфекциядән соң 48 һәм 72 сәгатьтән соң җыелды, фильтрланды һәм ультрацентрифугалау ярдәмендә концентрацияләнде. Концентрацияләнгән вирус өслеге трансдукциягә кадәр -80°C температурада сакланды.
PBMC сәламәт донор лейкоцитларын аеру продуктларыннан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тыгызлык центрифугасы ярдәмендә аерыла. PBMCдан CD8+ күзәнәкләрен аеру өчен уңай сайлау CD8 микробөреләрен (Miltenyi) кулланыгыз. Т күзәнәкләрен TransAct (Miltenyi) белән һәм TexMACS мохитендә стимуллаштырыгыз [Miltenyi; 3% җылылык белән инактивлаштырылган кеше сывороткасы, 1% PenStrep һәм IL-2 (300 U/ml) белән тулыландырылган]. Стимуллаштырудан соң егерме дүрт сәгать үткәч, Т күзәнәкләре лентивирус белән трансдукцияләнде (106 күзәнәккә 10 мкл концентрацияләнгән вирус өслеге). Cytek Aurora'да трансдукциядән соң 1-3 көн үткәч (FSC (Алга таралу)/SSC (Ян таралу), Singlet, GFP+'та), күзәнәкләрнең GFP экспрессиясен бәяләгез, трансдукция нәтиҗәлелеге ким дигәндә 30% булуын күрсәтегез.
CAR-T күзәнәкләре Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep белән тулыландырылган) системасында 24 сәгать дәвамында түбәндәге шартларда үстерелде: эшкәртелмәгән, 250 мкМ аденозин яки 10 мМ MNA белән эшкәртелгән. Алдан эшкәртүдән соң, CAR-T күзәнәкләре PBS белән юылды һәм 10% FBS һәм 1% PenStrep белән тулыландырылган 20,000 SK-OV-3 күзәнәкләре [ATCC; McCoy 5A мохитендә (Sigma-Aldrich) 10% FBS һәм 1% PenStrep белән кушылды: 1 эффекторның максатка нисбәте өстәмә Immunocult мохитендә өч тапкыр көчәйтелде. Саниталис сапонины (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich) белән лизисланган SK-OV-3 күзәнәкләре һәм SK-OV-3 күзәнәкләре тискәре һәм уңай контроль төркем буларак кулланылды. 24 сәгать бергәләп үстергәннән соң, өслек катламы җыелды һәм лактатдегидрогеназа (LDH) җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп үлчәнде (LDH Glo Cytotoxicity Analysis Kit, Promega). LDH өслек катламы LDH буферында 1:50 нисбәтендә сыекландырылды. Үтерү проценты түбәндәге формула ярдәмендә үлчәнде: үтерү проценты = төзәтү проценты / максималь үтерү тизлеге x 100%, монда төзәтү проценты = бергәләп үстерелгән Т күзәнәкләре генә, һәм максималь үтерү тизлеге = уңай контроль-тискәре контроль.
Текстта яки материалларда һәм методларда тасвирланганча, статистик анализ өчен GraphPad Prism 8, Microsoft Excel яки R v3.6.0 кулланыгыз. Әгәр бер үк пациенттан берничә үрнәк җыелса (мәсәлән, асцит һәм шеш), без парлы t-тест кулланабыз яки пациентны очраклы эффект буларак сызыклы яки гомумиләштерелгән модельгә кертәбез. Метаболомика анализы өчен мөһимлек тесты өч тапкыр башкарыла.
Бу мәкалә өчен өстәмә материаллар белән http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 сылтамасы буенча танышырга мөмкин.
Бу - Creative Commons Attribution-Nocommercial License шартлары нигезендә таратылган ачык керү мөмкинлеге булган мәкалә, ул теләсә нинди материалда кулланырга, таратырга һәм күчереп алырга мөмкинлек бирә, ләкин соңгы куллану коммерция максатларында булмаган һәм төп эш дөрес булган очракта. Сылтама.
Искәрмә: Без сездән электрон почта адресыгызны гына сорыйбыз, шуңа күрә сез биткә тәкъдим иткән кеше сезнең электрон хатны күрүен теләвегезне һәм аның спам түгеллеген белсен. Без бернинди электрон почта адресларын да теркәмәячәкбез.
Бу сорау сезнең кунак булу-булмавыгызны тикшерү һәм спамның автоматик рәвештә җибәрелүен булдырмау өчен кулланыла.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара МакФерсон (Сара МакФерсон), Лорен Г.
MNA Т күзәнәкләренең иммун супрессиясенә өлеш кертә һәм кеше яман шешен дәвалау өчен потенциаль иммунотерапия максаты булып тора.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара МакФерсон (Сара МакФерсон), Лорен Г.
MNA Т күзәнәкләренең иммун супрессиясенә өлеш кертә һәм кеше яман шешен дәвалау өчен потенциаль иммунотерапия максаты булып тора.
© 2021 Фән үсеше өчен Америка Ассоциациясе. барлык хокуклар сакланган. AAAS - HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef һәм COUNTER партнеры. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.