Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS өчен чикләнгән ярдәм күрсәтелә. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Умырткалылардан аермалы буларак, бөҗәкләрдә ир-атларга юнәлтелгән җенес стероид гормоннары җитми дип санала. Anopheles gambiae'да экдизон стероиды 20-гидроксиэкдизон (20E) ана кортлар тарафыннан синтезланганда йомырка үсешен контрольдә тоту һәм ир-атлар тарафыннан җенес юлы белән күчерелгәндә парлашу рефрактер чорын китереп чыгару өчен эволюцияләшкән кебек3. Йомырка үсеше һәм парлашу репродуктив үзенчәлекләр булганлыктан, ана Anopheles чебеннәренең бу гормональ сигналларны ничек интеграцияләүләрен аңлау маляриягә каршы көрәшнең яңа программаларын эшләүне җиңеләйтергә мөмкин. Монда без бу репродуктив функцияләрнең экдистероидларны активлаштыручы/активлаштыручы ферментларның катлаулы челтәре аша аерым җенес стероидлары белән көйләнүен ачыклыйбыз. Без ир-атларга хас оксидлаштырылган экдизонны, 3-дегидро-20E (3D20E) ачыкладык, ул җенес юлы белән күчерелгәннән соң хатын-кызларның җенес кабул итүчәнлеген туктатып һәм дефосфорлаштыру ярдәмендә активлаштырып, ата-ананы саклый. Шунысы игътибарга лаек, 3D20E күчерүе шулай ук ​​Plasmodium инфекциясе вакытында йомырка үсешен тәэмин итүче репродуктив геннарның экспрессиясен китереп чыгарды, зарарланган ана кортларның сәламәтлеген тәэмин итте. Ана кортлардан алынган 20E... җенси җавап бирми, ләкин парлашучы затларга 20E-ингибирлаучы киназалар ингибирланганнан соң йомырка салырга мөмкинлек бирә. Бу ир-атларга хас бөҗәк стероид гормонын ачыклау һәм аның хатын-кызларның җенси кабул итүчәнлеген, уңдырышлылыгын һәм Плазмодий белән үзара бәйләнешен көйләүдәге роле малярия таратучы чебеннәрнең репродуктив уңышын киметү мөмкинлеген күрсәтә.
Малярия очраклары һәм үлем очраклары тагын арта4, чөнки кеше малярия паразитларының бердәнбер векторы булган Anopheles чиркейләрендә инсектицидларга каршы торучанлык киң таралган. Бу чиркейләрнең парлашу биологиясе яңа маляриягә каршы көрәш чаралары өчен аеруча җәлеп итүчән максат булып тора, чөнки ана чиркейләр бер тапкыр гына парлаша5; бу парлашу вакыйгасын стерильләштерү кырдагы чиркейләр популяциясен киметү өчен зур мөмкинлекләр тудырыр иде.
Хатын-кызлар ирләрдән югары титрлы стероид гормоннар алганнан соң җенси яктан сәләтсезләнәләр. Тикшеренүләр күрсәткәнчә, алга таба парлашу кыенлыкларының сәбәбе - 20-гидроксиэкдизон (20E), ул личинка стадиясендәге эретү циклын көйләүче буларак билгеле стероид гормон. Аталарның 20E синтезлау һәм күчерү сәләте, Африкада таралган һәм маляриянең иң куркыныч векторларын, шул исәптән Anopheles gambiae да үз эченә алган Cellia7 суброды составына кергән Anopheles төрләрендә, аеруча үсеш алган. Бу аеруча игътибарга лаек, чөнки бу төрләрдә аналарның һәр кан ашаганнан соң 20E җитештерәләр, һәм 20E оогенез циклын хәрәкәткә китерә (8 нче сылтаманы карагыз). Ләкин, аналарның экдизонның ике төрле чыганагыннан (атларның күчерүе һәм кан ашату индукциясе) сигналларны ничек интеграцияләүләре турында аз мәгълүмат бар, аларның парлашу сәләтенә зыян китермичә. Чынлыкта, аналарның җитештергән 20E җенси түземсезлекне кузгатса, бу гыйффәтле тукланучы кешеләрдә бала табуга китерәчәк, бу бу чиркейләрдә бик еш очрый торган хәл5.
Мөмкин булган аңлатма - A. gambiae аталары модификацияләнгән аталарга хас экдизонны күчерә, ул аналарның репродуктив юлларында сигнал каскадын активлаштыра, нәтиҗәдә парлашу тотрыксызлыгына китерә. Шулай да, умырткалыларда эстроген һәм андроген кебек күп стероид гормоннар булса да (9 нчы сылтамада каралган), безнең белүебезчә, бөҗәкләрдә андрогенга юнәлтелгән стероидлар ачыкланмаган.
Без модификацияләүче стероидлар эзләү өчен җенси яктан өлгергән A. gambiae ир-ат аксессуар бизендәге (MAG) стероид гормоннары репертуарын билгеләргә керештек. Элегрәк кулланылган азрак специфик ысул урынына, югары нәтиҗәле сыеклык хроматографиясен тандем масса-спектрометриясе (HPLC-MS/MS) белән берләштереп, без бу тукымада экдизон (E) һәм 20E ачыкладык, бу алдагы нәтиҗәне раслады. Шулай да, үрнәктә оксидлаштырылган фосфорланган стероидлар өстенлек итте, бу 3-дегидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 формуласына туры килә (1 нче рәсем). Башка формаларга 3-дегидро-20E (3D20E) һәм 20E-22-фосфат (20E22P) керә. 3D20E22P-ның HPLC-MS/MS сигнал интенсивлыгы аның дефосфорланган формасы 3D20E-дан ике тапкыр югарырак һәм E һәм 20E-дан өч тапкыр югарырак иде (1 нче рәсем). Башка өлешләрендә дә... тән һәм аскы репродуктив трактлар (LRT; Киңәйтелгән мәгълүматлар 1a рәсем). Шулай ук ​​без яңа ябылган (<1 көнлек) ир-атларда һәм хатын-кызларда экдистероидларны анализладык һәм MAGда гына 3D20E һәм 3D20E22P ачыкладык; E, 20E һәм 20E22P ике җенестә дә бар иде (Киңәйтелгән мәгълүматлар 1b рәсем). Бу мәгълүматлар A. gambiae өлкән аталарының MAGларында хатын-кызлар тарафыннан синтезланмаган югары титрлы модификацияләүче гормоннар җитештерүен күрсәтә.
MAG һәм ана LRT (шул исәптән йөрәк сөяге, орлык күперчекләре һәм пароварий) 4 көнлек (4 көнлек) гыйффәтле аталардан һәм гыйффәтле һәм парлаштырылган аналардан (0,5, 3 һәм 12 ат/мин) алынды. Бу тукымаларда экдизон HPLC-MS/MS ярдәмендә анализланды (уртача ± сем; парланмаган t-тест, ике яклы, ялган ачыклау тизлеге (FDR) төзәтелгән; NS, әһәмиятле түгел; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 сәгать vs. 0,5 сәгать, P = 0,035; 12 сәгать vs. 3 сәгать, P = 0,0015; 12 сәгать vs. 0,5 сәгать, P = 0,030. 3D20E22P: 3 сәгать vs. 0,5 сәгать, P = 0,25; 12 сәгать vs. 3 сәгать, P = 0,0032; 12 сәгать vs. 0,5 сәгать, P = 0,015). Мәгълүматлар өч биологик кабатлаудан алынган. Һәр кызыклы экдизон өчен пик мәйданы исәпләнгән һәм чебеннәр саны белән нормальләштерелгән. Экдизон түбәндәге төс белән күрсәтелгән: E, яшел; 20E, кызгылт сары; 20E22P, шәмәхә; 3D20E, зәңгәр; 3D20E22P, алсу. Кертмә y күчәрендәге масштабны арттыра, экдизонның түбәнрәк дәрәҗәсен күрсәтә.
3D20E22P һәм 3D20E парлашу вакытында күчереләме-юкмы икәнен тикшерү өчен, без парлашудан соң төрле вакыт нокталарында ана LRTларны аердык. Экдизон гыйффәтле кызлар арасында табылмаса да, без парлашудан соң шунда ук LRTда күп күләмдә 3D20E22P күзәттек (парлашудан соң 0,5 сәгать, ат/мин), вакыт узу белән кими, ә 3D20E дәрәҗәләре сизелерлек арткан (1 нче рәсем). Химик юл белән синтезланган 3D20Eны стандарт буларак кулланып, без парлашу LRTларындагы бу стероид гормон дәрәҗәләренең 20E дан ким дигәндә 100 тапкыр югарырак булуын ачыкладык (Киңәйтелгән мәгълүматлар таблицасы 1). Шулай итеп, 3D20E22P - парлашу вакытында ана LRTга күчерелә торган төп ата экдизон, һәм аның дефосфорланган формасы, 3D20E, парлашудан соң күпкә күбрәк була. Бу соңгы экдизонның хатын-кызларның парлашудан соңгы биологиясендә мөһим роль уйнавын күрсәтә.
Яңа РНК секвенирлау (РНК-seq) мәгълүматлар җыелмасын булдырганнан соң (2а рәсем), махсус төзелгән биоинформатика конвейерын кулланып, без экдизон киназасын (EcK), экдизон оксидазасын (EO) һәм 20E-модификацияләнгән фосфатаза генын кодлаучы экдизонны эзләдек. EPP) репродуктив тукымаларда экспрессияләнә. Без бер кандидат EPP генын һәм ике потенциаль EcK генын (EcK1 һәм EcK2) ачыкладык, ләкин яхшы кандидат EO генын таба алмадык. Шунысы игътибарга лаек, аерым EPP геннары Гамбия MAGларында югары дәрәҗәдә (98,9 процентиль) экспрессияләнде, ләкин хатын-кыз LRTларында түгел (2b рәсем), бу безнең көткәннәргә каршы килде, чөнки бу хатын-кыз тукымасында 3D20E22P депосфорлашуы булды. Шуңа күрә без ир-ат EPP парлашу вакытында күчерелергә мөмкин дип саныйбыз. Чыннан да, без парлашудан соң хатын-кыз аксымын яшерү өчен in vivo тотрыклы изотоп маркировкасын кулландык, бу фермент хатын-кыз атриумында MS тарафыннан ачыкланды (рәсем). 2c һәм 1 нче өстәмә таблица). MAG һәм парлаштырылган (ләкин гыйффәтле түгел) хатын-кыз LRT'да EPP булуы шулай ук ​​махсус антитәнчекләр ярдәмендә расланган (2d рәсем).
а, Һәр җенеснең репродуктив тукымаларында EcK, EO һәм EPP кодлаучы геннарны эзләү өчен махсус төзелгән биоинформатика торбаүткәргече. Уклар янындагы саннар һәр адымда ир-ат һәм хатын-кыз кандидатлар санын күрсәтә. Бу анализ ир-атларда экспрессияләнгән бер EPP гены (EPP) һәм бер EcK гены (EcK1), һәм ике җенестә дә экспрессияләнгән, ләкин кандидат EO гены бирмәгән бер EcK гены (EcK2) ачыклады.b, Кыз (V) һәм парлашу (M) Anopheles gambiae һәм Anopheles albicans тукымаларында кандидат ген экспрессиясен чагыштыручы җылылык картасы. Spca, аталандыру; MAGs, ир-атларда өстәмә бизләр; тәннең башка өлешләрендә, шул исәптән күкрәкләрдә, канатларда, аякларда, майлы тәннәрдә һәм эчке органнарда, ә хатын-кызларда йомыркалыкларда. EcK2 Гамбиянең MAG һәм йөрәкчәләрендә югары дәрәҗәдә экспрессияләнә, ә EPP бары тик MAG.c да очрый. Ир-ат эякулят төркеменең хатын-кыз йөрәкчәләренә 3, 12 һәм 24 ат көчендә транслокациясенең протеомик анализы, бу иң күп булган 67 аксымны күрсәтә. Хатын-кызлар барлык аксымнарны билгеләү (һәм маскировкалау) өчен 15N булган диетада үстерелде. Билгеләнмәгән ир-атлар билгеләнгән хатын-кызлар белән парлаштырылды, һәм хатын-кыз LRTлары протеомик анализ өчен 3, 12 һәм 24 ат көчендә аерылды (эякулятация аксымнарының тулы исемлеге өчен 1 нче өстәмә таблицаны карагыз). Кертмәдә, EPP, Eck1 һәм EcK2 гыйффәтле ир-атларның MAGында бу тукымаларның протеомик анализы ярдәмендә ачыкланды.d, EPP парлаштырылган хатын-кызларның MAG һәм LRTсында вестерн-блот ярдәмендә ачыкланды, ләкин гыйффәтле хатын-кызларда яки ир-атларда яки хатын-кызның калган өлешендә түгел. тән. Мембраналар бер үк вакытта антиактин (йөкләү контроле) һәм анти-ЭПП антитәнчекләре белән тикшерелде. Барлык ирләр дә гыйффәтле. Гель чыганагы мәгълүматлары өчен 1 нче өстәмә рәсемне карагыз. Вестерн-блотлар ике тапкыр ясалды, охшаш нәтиҗәләр белән.
EPP-ның экдистероид фосфофосфатаза активлыгы MAG-тан ​​аерылган 3D20E22P белән HPLC-MS/MS ярдәмендә инкубацияләнгәннән соң тикшерелде (Киңәйтелгән мәгълүматлар 2a рәсем). Моннан тыш, без EPP-ны РНК аша интерференция (RNAi) ярдәмендә тындырганда, бу аталарның репродуктив тукымаларында фосфатаза активлыгының нык кимүен ачыкладык (3a рәсем), һәм EPP тындырылган аталар белән парлашкан ана чебеннәр геннарның өлешчә тындырылуына карамастан, дефосфорланган 3D20E-ның сизелерлек түбән өлешен күрсәттеләр (3b рәсем) (Киңәйтелгән мәгълүматлар 2b,c рәсем). Киресенчә, без шул ук чебеннәрдә 20E22P/20E нисбәтендә сизелерлек үзгәрешләр ачыкламадык, бу ферментның 3D20E22P өчен специфик булуын күрсәтергә мөмкин (3b рәсем).
a, Ике чылбырлы EPP РНК (dsEPP) яки ике чылбырлы GFP РНК (dsGFP) контроль геннарын кулланып EPP тындыру нәтиҗәсендә MAG'та фосфатаза активлыгы кимүе. Һәр репликациядә егерме MAG пулы кулланылган (P = 0,0046, парлы t-тест, ике яклы), аерым нокталар белән күрсәтелгән. b, EPP тындырылган аталар белән парлаштырылган аналарда 3 ат көче/мин тизлегендә дефосфорланган 3D20E өлеше сизелерлек түбән булган (P = 0,0043, парсыз t-тест, ике яклы), ә 20E дәрәҗәләренә тәэсир итмәгән (P = 0,063, парсыз). t-тест, ике яклы). Мәгълүматлар 13, 16 һәм 19 ана коштан торган өч пулдан уртача ± сем буларак күрсәтелгән. c, EPP белән тындырылган ата кошлар белән парлаштырылган ана кошларның кабат парлашу күрсәткечләре күпкә югарырак булган (P = 0,0002, Фишерның төгәл тесты, ике яклы). Парлашу статусын тәэмин итү өчен ана кошларны башта парлашырга мәҗбүр иткәннәр; 2 көннән соң, алар трансген сперма йөртүче башка ата кошлар белән элемтәгә керделәр, трансгенның санлы ПЦР ачыклавы ярдәмендә кабат парлашу күрсәткечләрен бәяләделәр. d, EPP белән тындырылган ата кошлар белән парлаштырылган кан белән тукланган ана кошларның уңдырышлылыгы сизелерлек кимегән (P < 0,0001; Манн-Уитни тесты, ике яклы) һәм йомыркалар саны бераз кимегән (P = 0,088, Манн-Уитни тесты, ике яклы), ә уылдык чәчү тизлегенә тәэсир итмәгәннәр (P = 0,94, Фишерның төгәл тесты, ике яклы). Барлык панельләрдә дә n биологик яктан бәйсез чиркей үрнәкләре санын күрсәтә. NS, әһәмиятле түгел.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Аннары, без экдизон дефосфорлашуының аналарда парлашуга каршы торучанлыкны арттыру өчен мөһимлеген бәяләдек. Шунысы игътибарга лаек, EPP-ка зыян күргән аталар белән парлаштырылган аналар, өстәмә (трансген) аталар белән аралашканда, контроль аналарга караганда (10,4%) күпкә югарырак ешлыкта (44,9%) кабат парлаштылар (3в рәсем). Шулай ук ​​без фертильлекнең сизелерлек кимүен (3d рәсем, сулда) һәм бу аналарның салган йомыркалар санының бераз кимүен (3d рәсем, уртада) күзәттек, ә аналарның салган йомыркалар проценты (парлашу белән аналарда барлыкка килгән тагын бер җавап) тәэсир итмәде (3d рәсем, уңда). 3D20E22P өчен EPP-ның күзәтелгән спецификасын исәпкә алып, бу нәтиҗәләр парлашу вакытында күчерелгән EPP тарафыннан 3D20E активлашуы аналарның алга таба парлашуга кабул итүчәнлеген сүндерүдә мөһим роль уйнарга мөмкин дип күрсәтә, бу тәртип элек 20E-ның җенси күчүе белән бәйле иде. Шуңа күрә бу ир-атларга хас гормон хатын-кызларның фертильлегенә дә нык тәэсир итә.
Аннары, без химик синтезланган 3D20E (4a–c рәсем) һәм сатуда сатыла торган 20E кулланып, җенси яктан өлгергән гыйффәтле кызлардагы инъекция экспериментларында 20E һәм 3D20E активлыгын чагыштырдык. Без 3D20E ике концентрациядә дә аналарның парлашуга сизгерлеген сүндерүдә 20Eга караганда күпкә нәтиҗәлерәк булуын күзәттек (4d рәсем). Шунысы игътибарга лаек, LRTдагы 3D20E физиологик дәрәҗәсенең яртысы (инъекциядән соң 1066 pg һәм парлашудан соң 2022 pg) инъекциядән соң 24 сәгать эчендә, иң югары концентрациядә, парлашудан соң 18 pg булганда, 20E физиологик дәрәҗәсеннән (инъекциядән соң 361 pg) 20 тапкыр югарырак булган рефрактер аналарның өлешен китереп чыгарды; Киңәйтелгән мәгълүматлар таблицасы 1). Бу нәтиҗә 20E җенси юл белән күчү парлашуның рефрактер чорларына китерми дигән фикергә туры килә һәм 3D20E ата-ана-бала мөнәсәбәтләрен тәэмин итүдә төп фактор булуын күрсәтә. 3D20E шулай ук ​​гыйффәтле аналарда йомырка салу анализларында 20Eга караганда күпкә активрак булган (4e рәсем), бу өлешчә EPP тындырылганнан соң күзәтелгән нормаль йомырка салу тизлеге парлашу нәтиҗәсендә барлыкка килгән ана факторлар тарафыннан әле дә җитештерелгән калдык 3D20E активлыгы булу белән бәйле булуын күрсәтә.
(a,b) 20E'дан химик юл белән синтезланган 3D20E (a) бик югары конверсия/нәтиҗәлелек белән (мәгълүматлар өч бәйсез синтез реакциясеннән алынган уртача ± sem буларак күрсәтелгән) (b).c, Масса спектры (аскы яртысы) парлаштырылган ана LRT'да табылган экдизонга (өске яртысы).d, 20E (0.63 мкг, P = 0.02; 0.21 мкг, P < 0.0001; Фишерның төгәл тесты, ике яклы) һәм 10% этанол (0.63 мкг, P < 0.0001; 0.21 мкг, P < 0.0001; Фишерның төгәл тесты, 2 яклы) белән чагыштырганда, ә 20E контроль төркемгә караганда югарырак дозаларда гына күпкә югарырак булган (0.63 мкг, P = 0.0002; 0.21 мкг, P = 0.54; Фишерның төгәл тесты, 2 яклы).e, 3D20E инъекциясе гыйффәтле ана кошларда 10% этаноллы контроль төркемгә караганда күпкә югарырак уылдык чәчү тизлегенә китерде (0.21 мкг, P < 0.0001; 0.13 мкг, P = 0.0003; Фишерның төгәл тесты, ике яклы), ә контроль төркем белән чагыштырганда 20E югарырак дозаларда гына (0.21 мкг, P = 0.022; 0.13 мкг, P = 0.0823; Фишерның төгәл тесты, ике яклы). 3D20E югарырак дозаларда 20E белән чагыштырганда күпкә югарырак уылдык чәчү тизлегенә китерде (0.21 мкг, P = 0.0019; 0.13 мкг, P = 0.075; Фишерның төгәл тесты, ике яклы). Барлык панельләрдә дә n биологик яктан бәйсез чиркей үрнәкләре санын күрсәтә. NS, әһәмиятле түгел.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,001. Мәгълүматлар өч кабатлаудан алынган.
Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләрдә без стероид гормоннарның җенси юл белән күчүе MISO (Оогенезның парлашу стимуляторы 11) экспрессиясен китереп чыгаруын ачыкладык, бу хатын-кыз репродуктив гены, ул A. gambiae аналыкларын P. falciparum инфекциясеннән саклый. Иң үлемечле кеше малярия паразиты 13 аркасында сәламәтлек чыгымнары. MISOның малярия таралган районнарда Anopheles репродуктив сәламәтлеге өчен мөһимлеген исәпкә алып, без бу генның экспрессиясен 3D20E яки 20E гормоны нинди булуын билгеләргә булдык. Без 20E инъекциясенең HR3 һәм HR4 кебек кайбер ядро ​​гормон рецепторларын (HR) махсус яки көчлерәк итеп, һәм Vg14, 15, 16 кебек типик стероид максатларын, MISOның 3D20E тарафыннан көчлерәк итеп индукцияләнүен ачыкладык (Киңәйтелгән мәгълүматлар 3 нче рәсем). Шулай итеп, бу андроген стероид гормонының җенси юл белән күчүе аналыкларны паразит инфекциясе китергән чыгымнардан саклаучы механизмнарны китереп чыгара кебек. Моннан тыш, 3D20E ике изоформага да төрлечә тәэсир итә. E рецепторы EcR-ның, EcR-A индукцияләүче һәм EcR-B-ны басучы, һәм хатын-кызларның фертильлегенә тәэсир итүче башка парлашуны стимуллаштыручы геннарны, шул исәптән HPX15-ны, көчлерәк стимуллаштыручы. Бу EPP-тынычландырылган ир-атлар белән парлашкан хатын-кызларда күзәтелгән әһәмиятле фертильсезлекне аңлатырга мөмкин (Киңәйтелгән мәгълүматлар 3 нче рәсем). Бу мәгълүматлар җенескә хас функциянең нигезендә ятарга мөмкин булган ике экдизон гормоны белән өстенлекле рәвештә активлаштырылган аскы агым юлларының булуын күрсәтә.
Аннары, без биоинформатика конвейерында ачыкланган ике EcK генының функциясен тикшердек. EcK1 яки EcK2 ны тындыру ир-атларда үлемгә китергән (4a рәсемдәге киңәйтелгән мәгълүматлар), бу экдизон фосфорлашуы һәм шулай итеп инактивлашуы яшәү өчен мөһим булуын күрсәтә. EcK2 EcK1 га караганда югарырак дәрәҗәдә экспрессияләнгәнгә һәм MAG'ларда протеомика ярдәмендә ачыкланганга күрә (2b,c рәсемнәр һәм 2 нче өстәмә таблица), без аның экдистероид киназа активлыгын 20E белән инкубацияләп расладык, бу 20E22P фосфорлашуына китергән (2 нче рәсемдәге киңәйтелгән мәгълүматлар).4b). 3D20E субстрат буларак кулланганда, без фосфорлашкан 3D20E22P продуктын ачыклый алмадык (4c рәсемдәге киңәйтелгән мәгълүматлар), бу EcK2 өчен өстенлекле максат 3D20E урынына 20E булырга мөмкин дигәнне аңлата.
Безнең РНК-seq анализы буенча, EcK2 шулай ук ​​гыйффәтле аналарның LRTсында югары дәрәҗәдә экспрессияләнгән, анда ул парлашудан соң сүндерелгән (2b рәсем). Без бу мәгълүматларны расладык һәм EcK2 экспрессиясенә кан белән туклану тәэсир итмәвен ачыкладык (Киңәйтелгән мәгълүматлар 5a рәсем). Башлангыч MS экспериментларыбызны киңәйтеп, без 20E22P пигы 20E пигы белән тыгыз бәйләнгән икәнен ачыкладык (кан белән тукланганнан соң 22-26 сәгать; Киңәйтелгән мәгълүматлар 5b рәсем). Гыйффәтле аналарда EcK2 тындырылуы кан белән тукланганнан соң 26 сәгатьтән соң 20E һәм 20E22P чагыштырма нисбәтен 3 тапкыр арттырды (Киңәйтелгән мәгълүматлар 2c һәм 5c рәсемнәре), бу EcK2 нең аналарда 20E фосфорлавын да раслый. Шунысы игътибарга лаек, EcK2-ны югалткан гыйффәтле аналарда җенси кабул итүчәнлек тулысынча сакланган (Киңәйтелгән мәгълүматлар 5d,e рәсемнәре), бу аналарда 20E җитештерү парлашуга китермәвен күрсәтә. рефрактер чорлар. Шулай да, бу ана кошларның йомырка салу дәрәҗәсе контроль төркем белән чагыштырганда сизелерлек арткан, гыйффәтле кошларның 30% тан артыгы йомырка салган (Киңәйтелгән мәгълүматлар 5f рәсем). Әгәр кан ашатканнан соң ике чылбырлы Eck2 РНК (dsEcK2) инъекцияләре ясалган булса, уылдык чәчү булмаган, бу вакытта кан ашату аркасында 20E пигы кимегән. Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр кан суырганнан соң барлыкка килгән 20E уылдык чәчүне китереп чыгара ала дигән модельне хуплый, ләкин уылдык чәчү блокадасы (EcK2 һәм, бәлки, башка факторлар) парлашу белән сүндерелгәндә генә. 20E да, 3D20E инъекцияләре дә гыйффәтле кошларда EcK2 экспрессиясен тоткарламаганнар (Киңәйтелгән мәгълүматлар 5g рәсем), бу башка факторларның бу киназаны тоткарлавын күрсәтә. Шулай да, кан ашатканнан соң 20E дәрәҗәсе парлашу вакытында уңайсызлык тудыру өчен җитәрлек булмаган, ләкин җенси юл белән күчә торган 3D20E югары титрлары белән нәтиҗәле рәвештә стимуллаштырылган.
Безнең нәтиҗәләр A. gambiae репродуктив уңышын көйләүче механизмнар турында мөһим мәгълүмат бирә. Ир-атлар 3D20E югары титрларын синтезлау өчен эволюцияләнгән модель барлыкка килде, бу ир-атларга хас модификацияләнгән экдизон, ул аналарны алга таба парлашуга сизгерлеген киметү юлы белән ата-ана булуны тәэмин итә. Шул ук вакытта, бу малярия векторлары шулай ук ​​ир-атларга хас EPP җенси күчүенә җавап итеп аналарда 3D20E активлаштыру өчен нәтиҗәле система эшләп чыгардылар. Безнең белүебезчә, бу бөҗәкләрдә уникаль һәм мөһим функция башкаручы ир-ат һәм ана өстенлек иткән стероид гормон системасының беренче мисалы. Ир-атларга хас экдизон функциясе фаразланган, ләкин төгәл күрсәтелмәгән. Мәсәлән, күбесенчә кире кагылган гипотеза 18 - бу функцияләрне 20E прекурсоры E1 башкара ала. Дрозофилада моандрия кечкенә җенес пептидларының19,20 җенес күчүе белән башлана, алар хатын-кыз репродуктив юлын махсус җенес пептид рецепторлары аша иннервацияләүче нейроннар белән үзара бәйләнештә була21,22. Аныклау өчен өстәмә эш кирәк A. gambiae аналарында 3D20E белән контрольдә тотыла торган аскы агым сигнал каскадлары һәм бу каскадларның чебеннәр һәм дрозофилалар арасында сакланып калу-калмавын билгеләү.
Безнең тикшеренүдә ачыкланган 3D20E-ның хатын-кызларның уңдырышлылыгына һәм үз-үзен тотышына мөһим ролен исәпкә алып, 3D20E синтезына һәм активлашуына китерә торган юллар киләчәктә чиркейләрне контрольдә тоту стратегияләре өчен яңа мөмкинлекләр бирә, мәсәлән, стериль бөҗәк технология стратегияләрендә көндәшлеккә сәләтле стериль ата бөҗәкләрне булдыру. Кыргый рәвештә чыгару яки 3D20E-ны гыйффәтле уенда имитацияләү өчен кулланыгыз. 3D20E-ның ир-атларга хас функциясе A. gambiae һәм башка Cellia төрләре үзләренең орлыкларын парлашу тыгыннарына коагуляцияләү сәләтен алгач барлыкка килгән булырга мөмкин, чөнки бу күп санлы гормоннарны һәм гормоннарны активлаштыручы ферментларны нәтиҗәле күчерүгә мөмкинлек бирә. Үз чиратында, монандрияне гамәлгә ашыручы 3D20E эволюциясе ана бөҗәкләргә (MISO югары экспрессиясе аша) малярия таралуы югары булган районнарда репродуктив сәләтләрен хуплау механизмын тәэмин итә, бу турыдан-туры булмаган рәвештә Плазмодий тапшыруына өлеш кертә. Ана бөҗәкләрнең 20E-сы ана Anopheles чиркейләрендә P. falciparum-ның яшәвенә һәм үсешенә тирән йогынты ясавы күрсәтелгәнен исәпкә алып,24 ата бөҗәк һәм ана стероид гормон юллары хәзер чиркей-паразит үзара бәйләнешенең төп аспектлары булып тора.
A. gambiae G3 штаммнары стандарт бөҗәк шартларында үстерелде (26-28 °C, 65-80% чагыштырма дымлылык, 12:12 сәгать яктылык/караңгы фотопериод). Личинкалар балык азыгы белән порошок рәвешендә тукландырылды (TetraMin тропик кабырчыклары, Кой гранулалары һәм Тетра күл таякчыклары 7:7:2 нисбәтендә). Өлкән чиркейләргә 10% декстроза эремәсе һәм атна саен кеше каны бирелде (кан компонентларын өйрәнегез). Кыз чиркейләр очларын микроскопия ярдәмендә тикшергәннән соң, җенесләрне кузак стадиясендә аеру юлы белән алынды. DsRed трансгенын йөртүче ата чиркейләр элегрәк тасвирланган иде.
Мәҗбүри парлаштыру экспериментлары алдан тасвирланган протоколлар буенча үткәрелде. Табигый парлаштыру өчен, 4 көнлек гыйффәтле ана кошлар ике төн дәвамында җенси яктан өлгергән гыйффәтле ата кошлар белән 1:3 нисбәтендә тотылды. Ата кошларга dsEPP инъекциясе ясалган экспериментлар өчен, бергәләп читлеккә кую инъекциядән соң 3-4 нче көннәргә туры килде, бу вакытта фосфатаза активлыгы максималь рәвештә тындырылды (Киңәйтелгән мәгълүматлар 2б рәсем).
Чиркей тукымалары, калган мәетләр (тәннең калган өлеше) яки бөтен тән 100% метанолга бүленде һәм мончок белән гомогенлаштырылды (2 мм пыяла шарчыклар, 2400 әйләнү/мин, 90 сек). Тукымалар күләме һәм метанол күләме түбәндәгечә иде: тәннең калган өлеше, 1000 мклда 50; MAG, 50–100 80 мкл; ана LRT, 25–50 80 мкл. Чөкмә шул ук күләмдәге метанол белән икенче метанол экстракциясенә дучар ителде. Күзәнәк калдыклары центрифугалау ярдәмендә чыгарылды. Ике экстракциядән дә метанол кушылды һәм азот агымы астында киптерелде, аннары судагы 80% метанолның түбәндәге күләмнәрендә яңадан эретелде: тәннең калган өлеше, 50 мкл; MAG һәм ана LRT, 30 мкл.
Үрнәкләр LC коралына (Vanquish, Thermo Fisher) тоташтырылган масса-спектрометрда (ID-X, Thermo Fisher) анализланды. 25 °C температурада сакланган 3 мкм, 100 × 4,6 мм колонкага (Inspire C8, Dikma) 5 мкл үрнәк кертелде. LC өчен күчмә фазалар A (су, 0,1% кубыз кислотасы) һәм B (ацетонитрил, 0,1% кубыз кислотасы) иде. LC градиенты түбәндәгечә иде: 1 минут дәвамында 5% B, аннары 11 минут эчендә 100% B га кадәр арттырылды. 100% температурада 8 минуттан соң колонканы 5% B температурада 4 минут дәвамында кабат тигезләгез. Агым тизлеге 0,3 мл мин-1 иде. MS чыганагында ионлаштыру уңай һәм тискәре режимнарда җылытылган электроспрей ионлаштыру юлы белән башкарыла.
Масса-спектрометр тулы MS режимында 60,000 ачыклыкта m/z диапазонындагы мәгълүматларны 350 дән 680 гә кадәр үлчи. MS/MS мәгълүматлары [M + H]+ (барлык максатлар), [M - H2O + H]+ (барлык максатлар) һәм [M - H]- (фосфорланган максатлар) буенча алынган. MS/MS мәгълүматлары стандарт булмаган максатларның экдизон үзлекләрен раслау өчен кулланылган. Максатчан булмаган экдистероидларны ачыклау өчен, >15% чагыштырмача күплеге булган барлык HPLC пиклары өчен MS/MS мәгълүматлары анализланган. Бер конкрет үрнәкнең (барлык башка максатлар) абсолют күләмнәрен яки суюлтуларын исәпләү өчен саф стандартлардан (20E, 3D20E) булдырылган стандарт кәкреләр ярдәмендә саннарны билгеләгез, аларның бер ирдә табылган күләмнәргә эквивалентлыгын исәпләгез. 3D20E өчен саннарны билгеләү түбәндәге аддуктлар суммасын кулланып башкарылды: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Мәгълүматлар Tracefinder (4.1 версия) ярдәмендә алынды һәм санлаштырылды. MS/MS мәгълүматлары Xcalibur (4.4 версия) ярдәмендә анализланды. E, 20E һәм 3D20E MS спектрлары тиешле стандартлар белән чагыштырылды. 3D20E22P Жирар реактивы белән дериватизацияләү юлы белән анализланды. 20E22P m/z нисбәте белән анализланды.
3D20E22P MAG'тан чистартылды. Чистарту аналитик масштабта HPLC-MS/MS анализы белән бер үк LC шартларында квадруполь масса нигезендәге детектор (QDa, Acquity, Waters) белән ультра-эффектив сыек хроматограф (Acquity, Waters) кулланып башкарылды. 3D20E22P'га туры килә торган m/z элек билгеләнгәнчә бер үк саклау вакытында ачыкланганда фракция җыю башланды. Аннары алынган кушылмаларның сафлыгы югарыда тасвирланганча HPLC-MS/MS ярдәмендә тикшерелде.
Гомуми РНК 10-12 репродуктив тукымалардан яки тәннең башка өлешләреннән (башсыз) TRI реактивы (Thermo Fisher) кулланып, җитештерүче күрсәтмәләре буенча алынды. РНК TURBO DNase (Thermo Fisher) белән эшкәртелде. кДНК җитештерүче күрсәтмәләре буенча Moloney тычкан лейкемиясе вирусының кире транскриптазасы (M-MLV RT; Thermo Fisher) ярдәмендә синтезланды. Кире транскрипция өчен санлы ПЦР (RT-qPCR; Киңәйтелгән мәгълүматлар таблицасы 2) өчен праймерлар элек бастырылган иде24 яки Primer-BLAST26 кулланып эшләнгән иде, зурлыгы 70-150 б.п булган һәм экзон-экзон тоташуларын яки Primer пар праймерларын аерым экзоннарга өстенлек бирелгән иде. Өчтән дүрткә кадәр биологик кабатлаудан кДНК үрнәкләре RT-qPCR өчен суда дүрт тапкыр сыекландырылды. Санлау 15 мкл кабатлау реакцияләрендә башкарылды, аларда 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймерлар һәм 5 мкл сыекландырылган кДНК бар иде. Реакцияләр бер QuantStudio 6 Pro реаль вакытлы ПЦР системасы (Thermo Fisher) һәм мәгълүматлар Design and Analysis (2.4.3 версиясе) ярдәмендә җыелды һәм анализланды. Бу тикшеренүдә күрсәтелгәнчә, чагыштырма күләмнәр RpL19 рибосомаль генына (AGAP004422) нормальләштерелде, аның экспрессиясе кан белән туклану 27 яки парлашу 3 белән сизелерлек үзгәрмәде.
РНК сыйфаты Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ярдәмендә тикшерелде. Illumina парлы китапханәләре MIT һәм Гарвардның Брод институтында әзерләнде һәм эшләтелде. Сиквенцияләү укулары HISAT2 (2.0.5 версиясе) ярдәмендә гадәти параметрлар белән A. gambiae геномына (PEST штаммы, 4.12 версиясе) туры китерелде. Карталаштыру сыйфаты (MAPQ) баллары <30 булган укулар Samtools (1.3.1 версиясе) ярдәмендә бетерелде. Геннарга карталаштыру саны гадәти параметрлар белән htseq-count (0.9.1 версиясе) ярдәмендә саналды. Нормальләштерелгән уку саны исәпләнде һәм R (4.0.3 версиясе) версиясендә DESeq2 пакеты (1.28.1 версиясе) ярдәмендә дифференциаль ген экспрессиясе анализланды.
Экдизонны модификацияләүче ген кандидатлары башта PSI-BLAST алгоритмы (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ярдәмендә A. gambiae геномын эзләү юлы белән ачыкланды, түбәндәге сорау аксымнары эзлеклелеге белән параметрлар гадәти кыйммәтләрне кулланып: Bombyx mori (Керешү № NP_001038956.1), Musca domestica (Керешү № XP_005182020.1, XP_005175332.1 һәм XP_011294434.1) һәм Microplitis demolitor (Керешү № XP_008552646.1 һәм XP_008552645.1), B. mori (Керешү № NP_001036900), Drosophila melanogaster (Керешү № NP_651202) дан EcK, Apis mellifera (Керешү № XP_394838) һәм Acyrthosiphon pisum (Керешү № XP_001947166); һәм B. mori'дан EPP (Керешү № XP_001947166) NP_001177919.1 һәм NP_001243996.1) һәм D. melanogaster'ның EO (Керешү № NP_572986.1) (1 нче адым). Аннары, Гамбиядә репродуктив тукымаларда (хатын-кыз LRT яки MAG) югары мРНК экспрессиясенә (миллион карталаштырылган укуга >100 фрагмент/килобаза экзоннары (FPKM) яки >85%) нигезләнеп фильтрлау (2 нче адым). Спецификаны яхшырту өчен, без парлашу вакытында экдизонны синтезламый яки күчерми торган анофелес төре A. albimanus репродуктив тукымаларында да экспрессияләнә торган кандидат ферментларны сайладык. Кандидат геннары A. albimanus репродуктив тукымаларында түбән экспрессиягә (<100 FPKM яки <85 нче процентиль) нигезләнеп фильтрланды (3 нче адым). Соңгы фильтр буларак (4 нче адым), кандидат геннар түбәндәгеләрнең кимендә берсен канәгатьләндерергә тиеш: (1) парлашудан соң шактый югарырак дәрәҗәдә (P < 0,05) дифференциаль экспрессияләнгән геннар анализы буенча һәм (2) репродуктив булмаган тукымаларда (< 85 % яки <100 FPKM).
Без бөтен организмны изотопик маркировкалауга ирешү өчен алдан тасвирланган 28, 29, 30 ысулларын үзгәрттек. Кыскасы, кыргый типтагы Saccharomyces cerevisiae II типтагы (YSC2, Sigma) азотның бердәнбер чыганагы буларак (авырлык/күләм) 2% глюкоза (G7528, Sigma), 1,7% аминокислотасыз һәм аммоний сульфаты булган чүпрә азот нигезендә (BD Difco, DF0335) һәм 5% 15N аммоний сульфатында (NLM-713, >99%, Кембридж изотоп лабораторияләре) сынап каралды. Чүпрә центрифугалау юлы белән алынды һәм чиркей личинкалары кузаклы булганчы личинкалар белән тулысынча тукландырылды. Дүртенче яшьтәге үлемне булдырмас өчен балык оны белән өстәмә (300 личинкага 0,5 мг) кушылды. Аннары парлашу вакытында күчерелгән ата протеомны анализлау өчен маркировкаланмаган ата личинкалар белән парлашу экспериментларында бары тик ана личинкалар гына кулланылды.
4-6 көнлек 15N-белгечле гыйффәтле ана кошлар яшь буенча туры килгән, билгеләнмәгән гыйффәтле ата кошлар белән парлашырга мәҗбүр ителделәр. Уңышлы парлашу эпифлуоресценция микроскопиясе астында парлашу тыгыннарын ачыклау юлы белән тикшерелде. 3, 12 һәм 24 ат/мин тизлектә 45-55 парлаштырылган ана кошларның йөрәкчәләре 50 мкл аммоний бикарбонаты буферына (рН 7.8) бүленеп алынды һәм пестле белән гомогенлаштырылды. Гомогенат центрифугаланды һәм өслек катламы 50 мкл 0.1% RapiGest (186001860, Уотерс) белән 50 мкл 50 мкл аммоний бикарбонатында кушылды. Һәр үрнәктән өслек катламы һәм гранула коры бозда туңдырылды һәм төнлә Вашингтон Университетындагы МакКосс лабораториясенә җибәрелде, анда LC-MS/MS өчен үрнәк әзерләү тәмамланды. Грануланы 50 мкл 0.1% RapiGest 50 мкл 50 мкл аммонийда кабат эретегез. бикарбонат һәм соникатты су мунчасында куллану. Пеллетның һәм өслек катламының аксым концентрациясе BCA анализы ярдәмендә үлчәнде, үрнәкләр 5 мМ дитиотреитол (DTT; Sigma) белән киметелде, 15 мМ йодоацетамид (Sigma) белән алкиллаштырылды һәм 37 °C (1:0 50) температурада 1 сәгать дәвамында трипсинизация: трипсин:субстрат нисбәте белән инкубацияләнде). RapiGest 200 мМ HCl өстәп лизисланды, аннары 37 °C температурада 45 минут инкубацияләнде һәм 4 °C температурада 10 минут дәвамында 14,000 әйләнү/мин тизлектә центрифугаланды, калдыкларны бетерү өчен. Үрнәкләр ике режимлы каты фазалы экстракция (Oasis MCX картриджлары, Waters) белән юылды һәм 0,1% кумырска кислотасында 0,33 мкг мкл-1 соңгы аксым концентрациясе өчен яңадан эретелде. Билгеләнмәгән MAG протеомнары да шулай ук ​​гыйффәтлелектән анализланды. ирләр. Һәр үрнәк өчен ике аналитик кабатлау анализланды. Аннары, һәрберсеннән 1 мкг 25 см эретелгән кремний диоксиды 75 мкм колонка, Jupiter C12 кире фазалы смола (Phenomenex) белән тутырылган 4 см эретелгән кремний диоксиды Kasil1 (PQ) фрит тозагы һәм 180 минутлык сыек хроматография ярдәмендә анализланды. Үрнәк дайджестлары – MS/MS Q-Exactive HF масса-спектрометрында (Thermo Fisher) nanoACQUITY UPLC системасы (Waters) белән эшләнде. Һәр эшләтеп җибәрү өчен булдырылган мәгълүматларга бәйле җыю мәгълүматлары Proteowizard (3.0.20287 версиясе) һәм Comet31 (3.2 версиясе) ярдәмендә Anopheles gambiae (VectorBase версиясе 54), Anopheles coluzzi'дан аксым эзлеклелекләрен үз эченә алган FASTA мәгълүмат базасына каршы mzML форматына үзгәртелде. Mali-NIH (VectorBase версиясе 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021 елның марты), A. gambiae RNA-seq һәм билгеле кеше пычраткычларының өч кадрлы тәрҗемәләрендә эзләү үткәрелде. Пептид картасы белән туры китерелгән FDR'лар Percolator32 (3.05 версиясе) ярдәмендә 0.01 бусагасы белән билгеләнде, һәм пептидлар Limelight33'та аксым парсимониясе ярдәмендә аксым идентификацияләренә җыелды. (2.2.0 версиясе). Чагыштырмача аксым муллыгы, алдан тасвирланганча, һәр этапта һәр аксым өчен исәпләнгән нормальләштерелгән спектр муллыгы коэффициенты (NSAF) ярдәмендә бәяләнде. Һәр аксымга карата NSAF ике төрле биологик кабатлау үрнәкләре буенча уртача исәпләнде. 15N маркировкасы ана протеомны уңышлы яшерде, гәрчә маркировкаланган кызлар арасында аз күләмдә маркировкаланмаган аксым ачыкланса да. Без ана чимал үрнәкләрдә ата аксымының кимүен (1-5 спектр) бары тик техник этапларда гына теркәдек, анда чимал үрнәкләр ата/партлашу үрнәкләреннән соң HPLC "күчерү" нәтиҗәсендә тикшерелде. Маркировкаланган кызлар арасында "пычратучы матдәләр" буларак табылган вакыт-вакыт аксымнар 1 нче өстәмә таблицада күрсәтелгән.
Genscript'та ике антиген пептид, QTTDRVAPAPDQQQ (PA изотипы эчендә) һәм MESDGTTPSGDSEQ (PA һәм PB изотипы эчендә). Ике пептид берләштерелде, аннары KLH ташучы аксымына кушылды һәм Яңа Зеландия куяннарына кертелде. Дүртенче инъекциядән соң куяннар корбан ителде, һәм гомуми IgG аффинитет чистарту юлы белән аерылды. Иң EPP-специфик куяннан IgG алга таба вестерн-блоттинг өчен кулланылды.
Көнбатыш блотлары өчен, 4 көнлек гыйффәтле аталардан һәм гыйффәтле яки мәҗбүри парлаштырылган аналардан (парлашудан соң <10) MAG (n = 10, монда n биологик яктан бәйсез чиркей үрнәкләре санын күрсәтә) һәм ана LRT (n = 30) аерым өстәлде, аксым экстракциясе буферы (50 мМ Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% натрий дезоксихолат; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1 × протеаза ингибиторы коктейле (Roche)) аерым өстәлде. Үрнәкләр диссекциядән соң шунда ук мончок белән (2 мм пыяла шарчыклар, 2400 әйләнү/мин, 90 сек) гомогенлаштырылды. Эремәгән калдыклар 20 000 г температурада 4 °C температурада центрифугалау юлы белән чыгарылды. Аксымнар Bradford анализы (Bio-Rad) ярдәмендә санлаштырылды. Аннары 20 мкг MAG аксымы, 40 мкг LRT аксымы һәм 20 мкг Калдык күпчелек аксым денатурацияләнде һәм MOPS буферы ярдәмендә 10% Bis-Tris NuPAGE белән аерылды. Аксымнар iBlot2 күчерү системасы (Thermo Fisher) ярдәмендә поливинилиден фторид мембраналарына күчерелде. Мембраналар 1× PBS-T (PBSта 0,1% Tween-20) эчендә ике тапкыр юылды, аннары 22°C температурада 1 сәгать дәвамында Odyssey блоклаучы буферында (Li-Cor) блокланды. Мембраналар 4°C температурада төнлә махсус куян анти-EPP поликлональ беренчел антитәнчеге (блоклаучы буферда 1:700) һәм тычкан анти-актин моноклональ беренчел антитәнчеге MAC237 (Abeam; 1:4,000) белән селкетелде. Мембраналар PBS-T белән юылды, аннары 0,01% SDS һәм 680LT кәҗә антитәнчеге (Li-Cor) белән блоклаучы буферда икенчел антитәнчекләр (ишек анти-куян 800CW һәм кәҗә анти-тычкан 680LT (Li-Cor), икесе дә 1:20,000) белән инкубацияләнде. 0,2% Tween -20 22 °C температурада 1 сәгать дәвамында тотылды. Мембраналар PBS-T белән юылды һәм Odyssey CLx сканеры белән сурәткә төшерелде. Рәсемнәр Image Studio'да җыелды һәм эшкәртелде (5.2 версия). EPP-RA изоформасына (82 кДа) туры килә торган билгеле бер полоса табылмады.
EPP (гистидин фосфатаза доменын үз эченә алган AGAP002463-RB изоформасы буларак, NCBI сакланган домен эзләү 34) һәм EcK2 (AGAP002181) кодлау өлкәләре pET-21a(+) плазмидына (Novagen Millipore Sigma) клонлаштырылды; праймерлар Киңәйтелгән Мәгълүматлар Таблицасы 2дә күрсәтелгән. Сигез GS4 линкеры (тандемда) pET-21a(+)-EcK2 конструкциясенең C-терминалы 6xHis тегы алдыннан кертелгән. Рекомбинант аксымнар NEBExpress күзәнәксез E. coli аксым синтезы реакциясе (New England BioLabs) ярдәмендә җитештерелгән. Рекомбинант аксымнар NEBExpress Ni спин колонкалары (New England BioLabs) ярдәмендә чистартылган. Дигидрофолат редуктаза (DHFR) контроль аксымы NEBExpress күзәнәксез E. coli аксым синтезы комплектыннан ДНК шаблоны ярдәмендә җитештерелгән. Аксымнар PBS'та -20 °C температурада 3 айга кадәр 50% глицеринде сакланган.
EPP һәм тукыма экстрактларының фосфатаза активлыгы 4-нитрофенилфосфат (pNPP; Sigma-Aldrich) ярдәмендә үлчәнде. Реакция буферында 25 мМ Трис, 50 ​​мМ сиркә кислотасы, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА һәм 1 мМ ДТТ бар иде. Тукымалар реакция буферында гомогенлаштырылды һәм күзәнәк калдыклары центрифугалау ярдәмендә чыгарылды. 2,5 мг мл-1 pNPP булган реакция буферына фермент яки тукыма экстракт өстәп, реакцияне башлагыз. Реакция катнашмасы бүлмә температурасында караңгыда инкубацияләнде, һәм pNPPдан әйләндерелгән pNP күләме төрле вакытларда 405 нм да абсорбцияне үлчәү юлы белән билгеләнде.
In vitro EcK активлыгы өчен, аксым 200 мкл буферда (рН 7.5) 0.2 мг 20E яки 3D20E белән 27°C температурада 2 сәгать дәвамында 10 мМ HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 мМ АТФ һәм 10 мМ MgCl2 булган 200 мкл буферда (рН 7.5) 0.2 мг 20E яки 3D20E белән инкубацияләнде. Реакция 800 мкл метанол өстәп туктатылды, аннары -20°C температурада 1 сәгать суытылды, аннары 20,000 g температурада 4°C температурада 10 минут центрифугаланды. Аннары өслек катламы HPLC-MS/MS ярдәмендә анализланды. Контроль төркемендә кулланылган аксымнарны җылылык белән инактивлаштыру өчен, аксымнар PBS'та 50% глицеринде 95°C температурада 20 минут инкубацияләнде.
In vitro EPP активлыгы өчен, аксым 25 мМ Трис, 50 ​​мМ сиркә кислотасы, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA һәм 1 мМ DTT булган 100 мкл буферда (рН 7,5) 3D20E22P (HPLC-MS/MS белән чистартылган 18 пар MAGда табылган күләмгә тиң) белән 27 °C температурада 3 сәгать дәвамында инкубацияләнде. Реакция 400 мкл метанол өстәп туктатылды һәм -20 °C температурада 1 сәгать суытылды, аннары 20,000 g температурада 4 °C температурада 10 минут дәвамында центрифугаланды. Өслек катламы HPLC-MS/MS белән анализланды.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) һәм EcK2 (556 bp) өчен ПЦР фрагментлары катнаш җенесле башсыз чиркей мәетләреннән әзерләнгән кДНКдан көчәйтелде. eGFP контроленең ПЦР фрагменты (495 bp) алдан тасвирланган pCR2.1-eGFPдан көчәйтелде; ПЦР праймерлары Киңәйтелгән Мәгълүматлар Таблицасы 2дә күрсәтелгән. ПЦР фрагменты pL4440 плазмидасында инверсияләнгән T7 промоторлары арасына кертелгән. Плазмид конструкцияләре NEB 5-α компетентлы E. coli (New England Biolabs) дан алынган һәм куллану алдыннан ДНК секвенирлавы белән тикшерелгән (кертү эзлеклелеге өчен Өстәмә Мәгълүматлар 1 карагыз). T7 промоторына туры китерелгән праймерлар (Киңәйтелгән Мәгълүматлар Таблицасы 2) pL4440 нигезендәге плазмидтан кертмәне көчәйтү өчен кулланылган. ПЦР продуктының зурлыгы агароз геле электрофорезы белән расланган. dsRNA ПЦР шаблоннарыннан Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) кулланып транскрипцияләнгән һәм җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп элек тасвирланган үзгәрешләр белән чистартылган.
dsRNA инъекциясе өчен, эклозиядән соң 1 көн эчендә өлкән ир-ат яки хатын-кызның (Nanoject III, Drummond) күкрәк куышлыгына 10 нг nl-1 концентрациясендә 1380 нг dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) кертелде. Геннарның нокдаун дәрәҗәләре ким дигәндә өч биологик репликада РНК экстракциясе, кДНК синтезы һәм RT-qPCR ярдәмендә билгеләнде. Экдизон инъекциясе өчен, 4 көнлек гыйффәтле яки 6 көнлек гыйффәтле кан белән тукланган хатын-кызларга 0,13, 0,21 яки 0,63 мкг 20E яки 3D20E (Nanoject III, Drummond) эксперименталь конструкциягә карап, 1,3, 2,1 концентрациясендә кертелде яки 6,3 нг nl-1 кертелде. 10% 100 нл (күләм/күләм) кертегез. судагы этанол; 10% этанолдагы 100 нл 3D20E22P (MAG парында табылган күләмнең 75% ына тиң). Чиркейләр инъекция төркеменә очраклы рәвештә билгеләнде.
Умыртка чәчү анализлары өчен, 3 көнлек ана кошлар кеше каны белән тулысынча тукландырылды. Өлешчә тукланган яки тукланмаган чебеннәрне алып ташлагыз. Дәвалау ысулына карап, ана кошлар кан ашаганнан соң ким дигәндә 48 сәгать дәвамында дүрт төн дәвамында аерым уылдык чәчү савытларына урнаштырылды. Йомыркалар стереоскоп астында саналды (Stemi 508, Zeiss); парлашкан ана кошлар өчен личинкаларга әйләнгән йомыркалар уңдырышлы дип саналды.
Парлашу сынаулары өчен, ана кошларга парлашуга каршы торучанлык үстерү өчен, дәвалауга карап ким дигәндә 2 көн вакыт бирелде, һәм кыргый типтагы яшь буенча туры килгән ата кошлар соңыннан шул ук читлеккә кертелде. Ике төн үткәч, ана кошларга орлыкландырылган күперчекләр киселде һәм геном ДНКсы 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА һәм 25 мМ NaCl (рН 8.2) булган буферда туңдыру-эретү һәм ультратавыш белән чыгарылды. Үрнәкләр 55 °C температурада 15 минут дәвамында протеиназа К (0.86 мкг мкл-1) белән инкубацияләнде, аннары 95 °C температурада 10 минут инкубацияләнде. Чи геном ДНК препаратлары 10 тапкыр суюлтылды һәм Y хромосома эзлеклелеген qPCR белән ачыклауга дучар ителде; праймерлар Киңәйтелгән мәгълүматлар таблицасы 2дә күрсәтелгән. Y хромосома эзлеклелеге булмау парлашу булмавын күрсәтә.
Кабат парлашу анализлары өчен, көчләп парлаштырылган ана аарыларда парлашу тыгыннары булу-булмавы тикшерелде, бу парлашу статусын раслау өчен булды һәм ата аарылар булмаганда парлашуга чыдамлык үсеше өчен 2 көн вакыт бирелде, алдан тасвирланганча 36. DsRed трансген спермасын йөртүче ата аарылар аннары ана читлекләренә кертелде. Ике төн узгач, ана аарылардан үрчетү везикулалары аерылды, һәм геном ДНКсы югарыда тасвирланганча әзерләнде һәм DsRed трансгенын qPCR белән ачыклады; праймерлар Киңәйтелгән мәгълүматлар таблицасы 2дә күрсәтелгән. DsRed трансгенының булмавы кабат парлашу булмаганлыгын күрсәтте.
3D20E элек тасвирланганча синтезланган 37. Кыскасы, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) 10 мл суда эретелгән, аннары 30 мг платина карасы (порошок рәвешендә, Sigma-Aldrich) өстәлгән. Реакция катнашмасына O2 йомшак агымы өзлексез күбекләнгән, ул бүлмә температурасында болгатылган. 6 сәгатьтән соң реакцияне туктату өчен 30 мл метанол өстәлгән. Каталитик кисәкчәләрне бетерү өчен катнашма центрифугаланган. Өслек катламы бүлмә температурасында вакуумда корылыкка кадәр парга әйләндерелгән. Киптерелгән реакция продукты HPLC-MS/MS анализы өчен инъекция өчен 10% этанол һәм метанолда эретелгән. Конверсия тизлеге (20E дан 3D20E га кадәр) якынча 97% тәшкил иткән (4б рәсем), һәм синтезланган 3D20E ның MS спектры парлашкан аналарда табылган спектрга туры килгән (4в рәсем).
Легендада башкарылган статистик тестларның конкрет детальләре бар. Фишерның төгәл тестын, Мантель-Кокс тестын һәм Студентның t-тесты өчен GraphPad (9.0 версиясе) кулланылды. Кокран-Мантель-Хензель тестлары махсус R скрипты ярдәмендә башкарылды (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test сайтында бар). Мәгълүматлар бүленеше 0,05 әһәмиятлелек бусагасы белән Шапиро-Вилк тесты ярдәмендә нормальлеккә тикшерелде. Мәгълүматлар нормальлек тестын үтмәгәндә, Манн-Уитни тесты үткәрелде. Яшәү мәгълүматлары Мантель-Кокс тесты ярдәмендә анализланды. РНК-seq ген дәрәҗәсендәге дифференциаль экспрессия анализын үткәрү өчен DESeq2 пакеты (1.28.1 версиясе) кулланылды. Графиктагы горизонталь полоса медиананы күрсәтә. Барлык тестлар өчен дә P = 0,05 әһәмиятлелек кыйммәте бусага буларак кулланылды.
Тикшеренү дизайны турында тулырак мәгълүмат алу өчен, әлеге мәкаләгә сылтама белән бирелгән Nature Research Report аннотациясен карагыз.
MS протеомик мәгълүматлары PXD032157 мәгълүматлар җыелмасы идентификаторы белән PRIDE партнер репозиторийы (https://www.ebi.ac.uk/pride/) аша ProteomeXchange консорциумына (http://proteomecentral.proteomexchange.org) күчерелде.
РНК-seq мәгълүматлар җыелмасы Gen Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) серияле GSE198665 язмасы астында саклана.
Агымдагы тикшеренү барышында булдырылган һәм/яки анализланган өстәмә мәгълүмат җыелмаларын тиешле авторлардан акылга сыярлык үтенеч буенча алырга мөмкин. Бу мәкаләдә чыганак мәгълүматлары китерелгән.
Де Луф, А. Экдистероидлар: Игътибарсыз бөҗәкләрнең җенси стероидлары? Ир: Кара тартма. Бөҗәк фәне. 13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гидроксиэкдизон һәм Anopheles stephens аналыкларының үсеше. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).