Секретор юлда аксымнарны сортлау күзәнәкнең бүленешен һәм гомеостазын саклап калу өчен бик мөһим. Кабык аша сортлаудан тыш, кинезиннарны сортлауда липидларның секретор транспорт процессындагы роле - күптәннән бирле җавап бирелмәгән төп сорау. Монда без in vivo шартларында яңа синтезланган гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизацияләнгән аксымнарның бик озын керамидлы липид өлешләре белән кластерлашуын һәм махсуслаштырылган эндоплазмаларның челтәр чыгу урынына классификацияләнүен исбатлау өчен 3D бер үк вакытта күп төсле югары сыйфатлы реаль вакытлы сурәтләү үткәрәбез, бу трансмембран аксымнары кулланганнан аерылып торган махсуслаштырылган эндоплазмаларның челтәр чыгу урынына классификацияләнә. Моннан тыш, без эндоплазматик челтәр мембранасындагы керамидның чылбыр озынлыгының бу сортлау селективлыгы өчен бик мөһим булуын күрсәтәбез. Безнең тикшеренү аксым йөкләрен липид чылбыры озынлыгына нигезләнеп секретор юлдагы сайлап экспортлау урыннарына классификацияләү өчен беренче туры in vivo дәлилләрен бирә.
Эукариот күзәнәкләрендә эндоплазматик челтәрдә (ЭР) синтезланган аксымнар аннары секретор юл аша транспорт вакытында сортлана, аларның тиешле күзәнәк билгеләнү урынына җиткерелә (1). Каплау аша сортлаудан тыш, кайбер липидлар, аларны билгеле бер мембрана доменнарына туплап, сайлап чыгу нокталары булып та хезмәт итә ала дип озак вакыт фаразланды (2-5). Ләкин, бу мөмкин булган липидларга нигезләнгән механизмны исбатлау өчен турыдан-туры in vivo дәлилләре җитми. Бу төп проблеманы чишү өчен, без чүпрәдә гликозилфосфатидилинозитол (GPI) белән бәйләнгән аксымнарның (GPI-AP) ЭРдан ничек төрлечә экспортлануын өйрәндек. GPI-APлар - липидлар белән бәйләнгән күзәнәк өслеге аксымнарының төрлелеге (6, 7). GPI-AP - плазма мембранасының тышкы яфракларына гликолипид өлеше (GPI анкеры) аша беркетелгән бүленеп чыккан аксым. Алар ЭР люменында консерватив посттрансляция модификацияләре буларак ГПИ анкерларын кабул итәләр (8). Беркетелгәннән соң, GPI-AP Гольджи аппараты аша (5, 9) ERдан плазма мембранасына үтә. GPI якорьларының булуы GPI-APның трансмембраналы бүленеп чыгарылган аксымнардан (шул исәптән башка плазма мембранасы аксымнарыннан) секретор юл буйлап аерым күчерелүенә китерә (5, 9, 10). Чүпрә күзәнәкләрендә GPI-APлар эндоплазматик челтәрдә башка бүленеп чыгарылган аксымнардан аерыла, аннары каплау аксым комплексы II (COPII) белән төрелгән уникаль везикулаларга төрелә (6, 7). ER экспорт процессында бу классификация процессының детерминантлары ачык түгел, ләкин бу механизм липидларны, бигрәк тә GPI якоренең липид өлешен структураль үзгәртүне таләп итә ала дип фаразлана (5, 8). Чүпрәдә GPI липид үзгәртүе GPI беркетелгәннән соң шунда ук башлана, һәм күп очракларда ул керамидның 26-углеродлы озын чылбырлы туендырылган май кислотасына (C26:0) бәйләнүен китереп чыгара (11, 12). C26 керамиды - чүпрә күзәнәкләре тарафыннан әлегә кадәр җитештерелә торган төп керамид. Ул ERда синтезлана һәм аның күп өлеше COPII везикулалары аша Гольджи аппаратына экспортлана (13). GPI-APның ER экспорты, аерым алганда, дәвамлы керамид синтезын таләп итә (14, 15), һәм үз чиратында, Гольджи аппаратында керамидның инозитол фосфат керамидына (IPC) әйләнүе GPI анкер синтезына бәйле (16). Ясалма мембраналар белән биофизик тикшеренүләр бик озын ацил чылбырлы керамидларның уникаль физик үзлекләргә ия булган тәртипләнгән доменнар барлыкка китерү өчен кушыла алуын күрсәтте (17, 18). Бу мәгълүматлар C26 керамиды һәм GPI-AP C26 керамиды белән үзләренең физик үзлекләрен кулланып, чагыштырмача пычрак ER мембранасы липид мохитендә тәртипле өлкәләргә яки өлкәләргә кушыла дигән гипотезага китерә. Ул, нигездә, кыска һәм туендырылмаган глицеролипидлардан тора (C16:1 һәм C18:1) (19, 20). Бу төбәкләр сайлап алынган рәвештә билгеле бер ER чыгу урыннарына (ERES) юнәлтеләчәк, анда керамид һәм керамид нигезендәге GPI-AP бер үк махсус COPII везикуласында Гольджига бергә күчерелергә мөмкин (5).
Бу тикшеренүдә без бу липидларга нигезләнгән механизмны супер-чишелешле конфокаль реаль вакытлы сурәтләү микроскопиясен (SCLIM) кулланып турыдан-туры сынап карадык, ул флуоресцент рәвештә билгеләнгән аксымнарны бер үк вакытта күзәтә алырлык алдынгы микроскопия ысулы. Өч төсле һәм өч үлчәмле (3D) сурәтләр тере күзәнәкләрдә бик югары чишелешкә һәм тизлеккә ия (21, 22).
Без башта SCLIM технологиясен кулланып, S. cerevisiae'да ER'дан чыкканнан соң трансмембран бүленеп чыккан аксымнардан C26 керамид төркеме булган нормаль GPI-AP'ның ничек тикшерелүен ачыкладык. ER классификациясен тикшерү өчен, без in vivo ERES'ка кергән яңа синтезланган йөкне турыдан-туры күрә алырлык генетик система кулландык (7, 23). Йөк буларак, без яшел флуоресцент аксым (GFP) белән билгеләнгән C26 керамид нигезендәге GPI-AP Gas1 һәм якын инфракызыл флуоресцент аксым (iRFP) белән билгеләнгән трансмембран бүленеп чыккан Mid2 аксымын сайладык, икесе дә плазма мембранасына юнәлтелгән (24–26). sec31-1 температурага сизгер мутантында бу ике йөк галактоза белән индукцияләнә торган промотор һәм конститутив ERES маркеры астында экспрессияләнә. Экстремаль температурада (37°C), sec31-1 мутациясе COPII каплау компоненты Sec31'ның COPII шытуын һәм ER экспортын тоткарлау функциясенә тәэсир иткәнлектән, яңа синтезланган йөк ER'да туплана (23). Түбән температурага (24°C) кадәр суытканнан соң, sec31-1 мутант күзәнәкләре секретор зонадан торгызылды, һәм тупланган яңа синтетик йөк ERдан чыгарыла башлады. CLIM визуализациясе күрсәткәнчә, яңа синтезланган Gas1-GFP һәм Mid2-iRFPның күбесе 37°C температурада инкубациядән соң һәм аннары 24°C температурада 5 минутка чыгарылганнан соң да sec31-1 мутант күзәнәкләренең ERда туплана (1 нче рәсем). Mid2-iRFP бөтен ER мембранасында таралганлыктан, ә Gas1-GFP өзекле ER мембрана өлкәсендә тупланып җыелганлыктан, аларның таралышы бөтенләй башкача (1 нче рәсем, A дан C га кадәр һәм Movie S1). Моннан тыш, 1D рәсемдә күрсәтелгәнчә, Gas1-GFP кластерында Mid2-iRFP юк. Бу нәтиҗәләр GPI-AP һәм трансмембран аксымнарының төрле ER мембрана өлкәләренә иртә аерылганлыгын күрсәтә. Gas1-GFP кластеры mCherry'ның COPII каплау аксымы Sec13 белән билгеләнгән билгеле бер ERES белән янәшә урнашкан (1 нче рәсем, E һәм F, һәм S1 фильмы) (23).
sec31-1 күзәнәкләре галактоза китереп чыгарган секрецияләрне экспрессияли, озын ацил чылбыры (C26) керамиды GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, яшел) һәм трансмембраналы аксым Mid2-iRFP (TMP, зәңгәр), һәм бу конструктив ERES маркировкасы Sec13-mCherry (ERES, кызгылт-көрән) 37°C температурада 30 минут инкубацияләнде, 24°C температурага күчерелде һәм 5 минуттан соң SCLIM ярдәмендә сурәтләнде. (A - C) яссылыкның берләштерелгән яки бер 2D сурәтен (A), 10 z-кисемтәнең 2D проекция сурәтен (B) яки йөк һәм ERES маркерларының 3D күзәнәк ярымшар сурәтен (C) күрсәтә. Масштаб сызыгы 1μm (A һәм B). Масштаб берәмлеге 0,551μm (C). Gas1-GFP дискрет ER өлкәләрендә яки кластерларында ачыкланды, ә Mid2-iRFP ачыкланды һәм ER мембранасы буенча таратылды (C). (D) График Gas1-GFP кластерындагы Gas1-GFP һәм Mid2-iRFP чагыштырма флуоресценция интенсивлыгын ак ук сызыгы (сулда) буенча күрсәтә. AU, теләсә нинди берәмлек. (E һәм F) товарларны һәм ERES билгесен берләштергән 3D рәсемне күрсәтә. Gas1-GFP кластерлары билгеле бер ERES янында ачыкланган. Масштаб берәмлеге 0,551 мкм. (F) Ак каты ук ERES белән бәйле Gas1-GFP кластерын билгели. Урта һәм уң панельләр берләштерелгән зурайтылган 3D рәсемне һәм сайланган Gas1-GFP кластерының әйләндерелгән күренешен күрсәтә.
Gas1-GFP кластеры һәм билгеле бер ERES арасындагы тыгыз киңлек мөнәсәбәте Gas1-GFP селектив ERESка керә алуын күрсәтә, бу Mid2-iRFP тарафыннан ERдан чыгу өчен кулланылган селективлыктан аерылып тора. Бу мөмкинлекне хәл итү өчен, без ERES нисбәтен бары тик бер яки ике товар өчен санлаштырдык (2 нче рәсем, А дан С га кадәр). Күпчелек ERES (70%) бер генә төр йөкне үз эченә ала икәнен ачыкладык. 2C рәсеменең аскы рәсемендә Gas1-GFP (1 нче рәсем) яки бары тик Mid2-iRFP (2 нче рәсем) булган ERESның ике типик мисалы күрсәтелгән. Киресенчә, ERESның якынча 20% бер үк өлкәдә капланган ике йөкне үз эченә ала. Кайбер ERES (10%) ике төр йөкне үз эченә алган, ләкин алар ачык төрле өлкәләрдә изоляцияләнгән. Шуңа күрә, бу статистик анализ ER экспортланганнан соң, GPI-AP Gas1-GFP һәм трансмембраналы Mid2-iRFP төрле ERESларга бүленә икәнен күрсәтә (2D рәсем). Бу сортлау нәтиҗәлелеге алдагы биохимик анализ (6) һәм морфологик билгеләү (7) белән бик туры килә. Шулай ук ​​без карантинга алынган йөкнең ERESка керүен күзәтә алабыз (2E рәсем һәм S2 фильмы). 2E рәсемендә Gas1-GFP (3 нче панель) яки Mid2-iRFP (4 нче панель)ның аз гына өлеше ERESка бер яктан керә һәм аерым өлкәдә чикләнгәнлеге күрсәтелгән. 2E рәсеменең 5 нче панелендә Gas1-GFP һәм Mid2-iRFP кайвакыт бер үк ERESта очрый, ләкин алар төрле яктан керә һәм төрле COPII везикулаларын күрсәтергә мөмкин булган аерым өлкәләрдә тупланган. Без шулай ук ​​C26 керамид нигезендәге GPI-AP Gas1 нең селектив ERES буларак күзәтелгән аерылуы һәм классификациясе специфик булуын расладык, чөнки башка трансмембраналы секреция йөке, GFP белән билгеләнгән плазма мембранасы аксымы Axl2 (27), Mid2-iRFPка охшаш үз-үзен тотышы күрсәтә. (S1 рәсем һәм S3 фильмы). Яңа синтезланган Axl2-GFP ER мембранасы аша Mid2-iRFP кебек тарала (S1, A һәм B рәсемнәре) һәм күпчелек ERES'ларда Mid2-iRFP белән бергә урнашкан (S1, B - D рәсемнәре). 1 нче рәсемнең 1 һәм 2 нче панельләре. S1C ике трансмембраналы йөк капланган ERES'ның ике типик мисалын күрсәтә. Бу очракларда ике товар да ERES'ка бергә керә (S1E рәсеме, 3 нче панель һәм S3 фильмы).
Галактоза индукцияләнә торган секрецияләрне экспрессияләүче sec31-1 күзәнәкләре, Gas1-GFP (GPI-AP, яшел) һәм Mid2-iRFP (TMP, зәңгәр), һәм Sec13-mCherry (ERES, кызгылт көк) конститутив ERES билгеләмәсе 37 градуска урнаштырылды. °C температурада 30 минут инкубацияләгәннән соң, секреция блогын чыгару өчен 24 °C температурага күчерегез, һәм 20 минуттан соң SCLIM белән рәсем ясагыз. (A - C) Йөкнең һәм ERES белән билгеләнгән 10 z-кисемтәнең репрезентатив 2D проекция рәсемнәре (A; масштаблы сызык, 1 мкм) яки 3D күзәнәк ярымшар рәсемнәре (B һәм C; масштаблы берәмлек, 0,456 мкм). (B) эчендәге аскы панель һәм (C) эчендәге панель ERESта булган товарларны гына күрсәтү өчен эшкәртелгән рәсемнәрне күрсәтә (кызгылт көк) [Gas1-GFP (соры) һәм Mid2-iRFP (ачык зәңгәр)]. (C) Ачык ук: ERES бер генә йөк кисәген йөртә (1 дән 4 кә кадәр). Соры ук: ERES аерым йөкне үз эченә ала (5). Ак төстәге бер үк ук: бергә урнашкан йөкне үз эченә алган ERES. Аста: Сайланган бердәнбер ERES составында Gas1-GFP (1) яки Mid2-iRFP (2) гына бар. Масштаб сызыгы, 100 нм. (D) (C) пунктында тасвирланган фотомикрографның санлаштыруы. Бер генә йөкне (Gas1-GFP яки Mid2-iRFP), аерым йөкне һәм капланган йөкне үз эченә алган ERESның уртача проценты. Өч бәйсез экспериментта 54 күзәнәктә n=432. Хата сызыгы = SD. Ике койрыклы парланмаган t-тест. *** P = 0.0002. (E) Карантинга куелган йөкнең сайланган ERES-ның 3D рәсеме (C) белән билгеләнгән. Gas1-GFP (яшел) (3) яки Mid2-iRFP (зәңгәр) (4) бер яктан ERESка (шәмәхә) керә һәм ERES эчендәге кечкенә бер өлкә белән чикләнгән. Кайвакыт ике төр йөк тә бер үк ERESка (5) бер үк яктан керә һәм ERES эчендәге аерым бер зона белән чикләнә. Масштаб полосасы, 100 нм.
Аннары, без ER мембранасында булган озын ацил чылбырлы керамид (C26) Gas1-нең специфик кластерлашуын һәм сайлап алынган ERES-ка сортлануын этәрә дигән гипотезаны тикшердек. Моның өчен без модификацияләнгән GhLag1 чүпрә штаммын кулландык, анда ике эндоген керамид синтазасы Lag1 һәм Lac1 GhLag1 (мамыкның Lag1 гомологы) белән алыштырылды, нәтиҗәдә күзәнәк мембранасы кыргый типтан кыскарак Керамид штаммы булган чүпрә штаммы барлыкка килде (3A рәсем) (28). Масса-спектрометрия (MS) анализы күрсәткәнчә, кыргый типтагы штаммнарда гомуми керамидның 95% бик озын (C26) чылбырлы керамид, ә GhLag1-дә керамидның 85% бик озын (C18 һәм C16). ), керамидның нибары 2% бик озын (C26) чылбырлы керамид. C18 һәм C16 керамидлары әлегә GhLag1 мембранасында ачыкланган төп керамидлар булса да, MS анализы шулай ук ​​GhLag1 штаммында экспрессияләнгән Gas1-GFP GPI якоре составында кыргый типтагы липидлар белән чагыштырырлык C26 керамид булуын раслады. Сыйфаты шул ук (3А рәсем) (26). Шуңа күрә, бу керамидны үзгәртүче Cwh43 ферменты C26 керамид өчен югары селектив булуын аңлата, 26 нчы рәсемдә күрсәтелгәнчә, ул GhLag1 штаммындагы аз күләмдәге C26 керамидыннан GPI якорен өстенлекле рәвештә кертә. S2 (29). Шуңа да карамастан, GhLag1 күзәнәк мембранасында, нигездә, C18-C16 керамид кына бар, ә Gas1-GFP составында әле дә C26 керамид бар. Бу факт бу штаммны ERда мембрана керамидының ацил чылбыры озынлыгы проблемасын махсус чишү өчен идеаль корал итә. Класс һәм сортлауның гипотетик роле. Аннары без башта C26 Gas1-GFP-ның GhLag1-дә температурага сизгер sec31-1 мутант аллеле белән кластерларда туплану сәләтен гадәти флуоресценция микроскопиясе аша өйрәндек, анда ER мембранасы Ceramide-та озын (C18-C16) чылбыр гына бар (3 нче рәсем). Без 31-1 секундта Gas1-GFP-ның күпчелек өлеше кластерларда туплануын, ә озын (C18-C16) озын керамид ER мембранасы белән 31-1 sec31-1 GhLag1-дә Gas1-GFP-ның, нигездә, кластерланмаганын һәм бөтен ER мембранасында таралганлыгын күзәттек. Төгәлрәк әйткәндә, C26 керамид нигезендәге кластерлашу билгеле бер ERES белән тыгыз бәйләнгәнлектән (1 нче рәсем), без бу процессның ER экспорт аксымы механизмы функциясен дә үз эченә алу-алмавын тикшердек. GPI-AP ER экспорты өчен махсус COPII системасын куллана, ул GPI якоренең гликан өлешен Ted1-ның структураль үзгәртеп коруы белән актив рәвештә көйләнә (30, 31). Рекомбинант GPI-гликан аннары трансмембраналы йөк рецепторы p24 комплексы тарафыннан таныла, ул үз чиратында сайлап Lst1 ны җәлеп итә, ул COPII йөк бәйләүче төп субберәмлеге Sec24 нең специфик изоформы булып тора, GPI-AP белән бай COPII везикулалары кирәк (31-33). Шуңа күрә без бу аерым аксымнарның делециясен (p24 комплексы компоненты Emp24, GPI-гликанны үзгәртү ферменты Ted1 һәм COPII специфик субберәмлеге Lst1) sec31-1 мутант штаммы белән берләштергән икеләтә мутант төзедек һәм аларны өйрәндек. Gas1-кластерлы GFP формалаштыру мөмкинме (3 нче рәсем). Без sec31-1emp24Δ һәм sec31-1ted1Δ'та Gas1-GFP'ның, нигездә, кластерсыз һәм ER мембранасы буйлап таралганын күзәттек, бу элек sec31-1 GhLag1'да күренгәнчә, ә sec31-1lst1Δ'та Gas1-GFP'ның sec31-1 кебек булуын күзәттек. Бу нәтиҗәләр ER мембранасында C26 керамид булудан тыш, Gas1-GFP'ның кластерлашуы да p24 комплексына бәйләнергә тиеш һәм махсус Lst1 җәлеп итүне таләп итми икәнен күрсәтә. Аннары без ER мембранасындагы керамидның чылбыр озынлыгы Gas1-GFP'ның p24'кә бәйләнүне көйли алу мөмкинлеген тикшердек. Ләкин, без мембранада C18-C16 керамидының булуы p24 комплексы белән торгызылган GPI-гликаннарга (S3 һәм S4 рәсемнәре, A һәм B) яки GPI-AP'ка бәйләнү һәм GPI-AP'ны экспортлау сәләтенә тәэсир итмәвен ачыкладык. COPII Lst1 субтибын җәлеп итегез (S4C рәсем). Шуңа күрә, C26 керамидына бәйле кластерлаштыру төрле ER экспорт аксымы механизмнары белән аксым үзара бәйләнешен таләп итми, ләкин липид озынлыгы белән идарә ителә торган альтернатив сортлау механизмын хуплый. Аннары без ER мембранасындагы керамид ацил чылбыры озынлыгының Gas1-GFPны сайлап алынган ERES буларак нәтиҗәле классификацияләү өчен мөһимме-юкмы икәнен анализладык. Кыска чылбырлы керамидлы GhLag1 штаммындагы Gas1 ERдан чыгып, плазма мембранасына кергәнлектән (S5 рәсем), без сортлау керамид ацил чылбыры озынлыгы белән идарә ителсә, GhLag1 штаммындагы Gas1 юнәлдерелергә һәм кисештерелергә мөмкин дип саныйбыз. Шул ук мембрана белән ERES товарлары.
(A) GhLag1 күзәнәк мембранасында, нигездә, кыскарак C18-C16 керамидлары бар, ә Gas1-GFP GPI якоре кыргый типтагы күзәнәкләр кебек үк C26 IPCга ия. Өстә: кыргый типтагы (Wt) һәм GhLag1p штаммнарының күзәнәк мембранасындагы керамидның ацил чылбыр озынлыгы анализы масса-спектрометрия (MS) ярдәмендә. Мәгълүматлар гомуми керамидның процентын күрсәтә. Өч бәйсез экспериментның уртача күрсәткече. Хата юлы = SD. Ике койрыклы парланмаган t-тест. **** P <0.0001. Аскы панель: кыргый типтагы һәм GhLag1p штаммнарында күрсәтелгән Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI якорендә булган IPCның ацил чылбыр озынлыгының MS анализы. Мәгълүматлар гомуми IPC сигналының процентын күрсәтә. Биш бәйсез экспериментның уртача күрсәткече. Хата юлы = SD. Ике койрыклы парланмаган t-тест. ns, мөһим түгел. P = 0.9134. (B) Галактоза белән индукцияләнгән Gas1-GFP экспрессияләүче sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ һәм sec31-1lst1Δ күзәнәкләренең флуоресценция микрографияләре 37°C температурада 30 минут инкубацияләнде һәм 24°C температурадан соң гадәти флуоресценция микроскопиясен башкару өчен күчерелде. Ак ук: ER Gas1-GFP кластеры. Ачык ук: Кластерланмаган Gas1-GFP бөтен ER мембранасы буенча таралган, ER характеристикасы булган ядрә боҗрасын буяуны күрсәтә. Масштаб сызыгы, 5μm. (C) (B) пунктында тасвирланган фотомикрографның санлаштыруы. Nuqta Gas1-GFP структурасы булган күзәнәкләрнең уртача проценты. Өч бәйсез экспериментта n≥300 күзәнәк. Хата сызыгы = SD. Ике койрыклы парланмаган t-тест. **** P <0.0001.
Бу проблеманы турыдан-туры чишү өчен, без GhLag1'да sec31-1 температурага сизгер мутант аллелы белән Gas1-GFP һәм Mid2-iRFP'ның SCLIM визуализациясен үткәрдек (4 нче рәсем һәм S4 фильмы). ER 37°C температурада сакланганнан һәм аннан соң 24°C температурада чыгарылганнан соң, яңа синтезланган Gas1-GFP'ның күпчелек өлеше ER мембранасы буйлап кластерланмаган һәм таралган түгел, бу гадәти микроскоплар белән күзәтелгән (4 нче рәсем, A һәм B). Моннан тыш, ERES'ның зур өлеше (67%) анда бергә урнашкан ике төр йөкне үз эченә ала (4D рәсем). 4C рәсеменең 1 һәм 2 панельләрендә Gas1-GFP һәм Mid2-GFP капланган ERES'ның ике типик мисалы күрсәтелгән. Моннан тыш, ике товар да бер үк ERES'ка җәлеп ителде (4E рәсем, 3 нче панель һәм S4 фильмы). Шуңа күрә, безнең нәтиҗәләр ER мембранасындагы керамид ацил чылбырының озынлыгы ER аксым агрегациясе һәм классификациясенең мөһим детерминанты булуын күрсәтә.
Sec31-1 Галактоза белән индукцияләнгән секрецияләрне экспрессияләүче GhLag1 күзәнәкләре, Gas1-GFP (GPI-AP, яшел) һәм Mid2-iRFP (TMP, зәңгәр) һәм ERES белән билгеләнгән Sec13-mCherry (ERES, кызгылт көк) 37°C температурада инкубацияләгез. 30 минут дәвам итегез, секрецияләрне чыгару өчен 24°C кадәр төшерегез һәм 20 минуттан соң SCLIM белән сурәтләгез. (A - C) Йөк һәм ERES белән билгеләнгән 10 z-кисемтәнең 2D проекция рәсемнәре (A; масштаблы сызык, 1μm) яки 3D күзәнәк ярымшар рәсемнәре (B һәм C; масштаблы берәмлек, 0,45μm). (B) аскы панель һәм (C) панель эшкәртелгән рәсемнәрне ERESта булган товарларны гына күрсәтү өчен күрсәтә (кызгылт көк) [Gas1-GFP (соры) һәм Mid2-iRFP (ачык зәңгәр)]. (C) Ак белән тутырылган ук: ERES, товарлар каплана. Ачык ук: ERES бер генә әйберне үз эченә ала. Аскы панель: Сайланган ERES бер-бер артлы капланган товарларга (1 һәм 2) (C) белән билгеләнгән. Масштаб сызыгы, 100 нм. (D) (C) белән билгеләнгән фотомикрографиянең санлаштыруы. 31-1 һәм 31-1 сек GhLag1 берәмлекләрендә бер генә йөк (Gas1-GFP яки Mid2-iRFP) кертелгән, һәм аерымланган йөк һәм капланган йөк өчен ERESның уртача проценты күрсәтелгән. Өч бәйсез экспериментта 54 күзәнәктә n = 432 (31-1 сек) һәм 47 күзәнәктә n = 430 (31-1 сек GhLag1). Хата сызыгы = SD. Ике койрыклы парсыз t-тест. *** P = 0.0002 (31-1 сек) һәм ** P = 0.0031 (31-1 сек GhLag1). (E) (C) белән билгеләнгән капланган йөк (3) белән сайланган ERESның 3D рәсеме. Gas1-GFP (яшел) һәм Mid2-iRFP (зәңгәр) бер үк яктан ERESка (алсу-кызыл) якынлашалар һәм бер үк ERES тыелган зонасында калалар. Масштаб полосасы, 100 нм.
Бу тикшеренү липид нигезендәге аксым йөкләренең секретор юлда сайлап экспортлау урыннарына классификацияләнүен турыдан-туры in vivo дәлилләр белән тәэмин итә һәм классификация сайлап алучанлыгы өчен ацил чылбыры озынлыгының мөһимлеген күрсәтә. SCLIM дип аталган көчле һәм алдынгы микроскопия ысулын кулланып, без чүпрәдә яңа синтезланган Gas1-GFP (бик озын ацил чылбырлы (C26) керамид липид өлеше булган төп плазма мембранасы GPI-AP) күрсәттек. Дискрет ERларда кластерлашкан өлкәләр билгеле бер ERES белән бәйле, ә трансмембраналы бүленеп чыккан аксымнар ER мембранасы буенча таралган (1 нче рәсем). Моннан тыш, бу ике төр товар төрле ERESка сайлап керә (2 нче рәсем). Мембранадагы күзәнәк керамидының ацил чылбыры озынлыгы C26дан C18-C16га кадәр кими, Gas1-GFP кластеры дискрет ER өлкәсенә таркала, һәм Gas1-GFP шул ук ERES аша трансмембраналы аксым белән ERдан китү өчен үзгәртелә (3 нче һәм 3 нче рәсем). 4).
GPI-AP ERдан чыгу өчен махсуслаштырылган аксым механизмын кулланса да, без C26 керамидына бәйле аерылуның ERES махсуслашуына китерергә мөмкин булган дифференциаль аксым үзара бәйләнешләренә бәйле түгеллеген ачыкладык (S4 һәм S5 рәсемнәре). Киресенчә, безнең ачышлар липид нигезендәге аксым кластерлаштыру һәм аннан соң башка йөкләрне чыгарып ташлау белән идарә ителә торган альтернатив классификация механизмын хуплый. Безнең күзәтүләребез күрсәткәнчә, билгеле бер ERES белән бәйле Gas1-GFP өлкәсендә яки кластерда трансмембраналы бүленеп чыккан Mid2-iRFP аксымы юк, бу C26 керамидына бәйле GPI-AP кластерының аларның тиешле ERESка керүен җиңеләйтәчәген һәм шул ук вакытта трансмембраналы бүленеп чыгуны чыгарып ташлаячагын күрсәтә (1 һәм 2 рәсемнәр). Киресенчә, ER мембранасында C18-C16 керамидларының булуы GPI-APның төбәкләр яки кластерлар формалаштыруына китерми, шуңа күрә алар трансмембраналы бүленеп чыккан аксымнарны шул ук ERESка чыгарып ташламыйлар яки алыштырмыйлар (3 һәм 4 рәсемнәр). Шуңа күрә без C26 керамидының билгеле бер ERES белән бәйләнгән аксымнарның кластерлашуын җиңеләйтү юлы белән аерылуны һәм классификацияне этәрүен фаразлыйбыз.
Бу C26 керамидына бәйле кластерны билгеле бер ER өлкәсенә ничек ирешергә? Мембрана керамидының яннан аерылу тенденциясе GPI-AP һәм C26 керамидының ER мембранасының кыскарак һәм туендырылмаган глицеролипидларны үз эченә алган тәртипсезрәк липид мохитендә кечкенә һәм тиз арада тәртипкә китерелгән липидлар барлыкка китерүенә китерергә мөмкин. Сыйфат кластерлары (17, 18). Бу кечкенә вакытлы кластерлар p24 комплексына бәйләнгәннән соң зуррак, тотрыклырак кластерларга кушылырга мөмкин (34). Моңа туры китереп, без C26 Gas1-GFPның зуррак күренмәле кластерлар барлыкка китерү өчен p24 комплексы белән үзара бәйләнешкә керергә тиешлеген күрсәттек (3 нче рәсем). p24 комплексы - чүпрәдәге дүрт төрле p24 трансмембран аксымыннан торган гетерозиготалы олигомер (35), ул күпвалентлы бәйләнешне тәэмин итә, бу кечкенә GPI-AP кластерларының үзара бәйләнешенә китерергә мөмкин, шуның белән зуррак тотрыклы кластер барлыкка китерә (34). GPI-AP аксым эктодоманилары арасындагы үзара бәйләнеш аларның агрегациясенә дә өлеш кертә ала, бу имезүчеләрнең поляризацияләнгән эпителий күзәнәкләрендә Гольджи транспорты вакытында күренә (36). Ләкин, ER мембранасында C18-C16 керамиды булганда, p24 комплексы Gas1-GFP белән бәйләнгәндә, зур аерым кластерлар барлыкка килмәячәк. Төп механизм озын ацил чылбырлы керамидның физик һәм химик үзлекләренә бәйле булырга мөмкин. Ясалма мембраналарның биофизик тикшеренүләре күрсәткәнчә, озын (C24) һәм кыска (C18-C16) ацил чылбырлы керамидлар фаза аерылуына китерсә дә, бары тик озын ацил чылбырлы керамидлар (C24) генә югары кәкрелекне һәм пленка бөгелүен стимуллаштыра ала, пленканы яңадан формалаштыра. Үзара сылтама аша (17, 37, 38). Emp24 кеше гомологы булган TMED2 трансмембран спираленең цитоплазматик лобулаларда C18 керамид нигезендәге сфингомиелин белән сайлап тәэсир итүе күрсәтелгән (39). Молекуляр динамика (MD) симуляцияләрен кулланып, без C18 һәм C26 керамидларының Emp24 трансмембран спираленең цитоплазматик лобулалары тирәсендә туплануын һәм аларның охшаш өстенлекләргә ия булуын ачыкладык (S6 рәсем). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, бу Emp24 трансмембран спираленең мембранада липидларның асимметрик таралуына китерергә мөмкинлеген күрсәтә. Бу имезүчеләр күзәнәкләренә нигезләнгән соңгы нәтиҗә. Охшаш MD симуляцияләре шулай ук ​​эфир липидларының булуын күрсәтә (40). Шуңа күрә без ER26 лобуласындагы C26 керамидының җирле рәвештә байытылган дип фаразлыйбыз. Люминаль лобулалардагы GPI-AP турыдан-туры күпвалентлы p24 белән бәйләнгәндә һәм цитоплазматик лобулалардагы p24 тирәсендә C26 керамид тупланганда, ул бармаклар аша аксым агрегациясен һәм мембрана кәкрелеген барлыкка китерүне стимуллаштыра ала (41), бу GPI-APның ERES янындагы аерым өлкәләргә аерылуына китерә, бу шулай ук ​​ER мембранасының бик кәкре өлкәләренә ярдәм итә (42). Элегерәк язылган докладлар тәкъдим ителгән механизмны хуплады (43, 44). Олиголектиннарның, патогеннарның яки ​​антитәнчекләрнең плазма мембранасында керамид нигезендәге гликосфинголипидларга (GSL) күпвалентлы бәйләнеше зур GSL агрегациясен стимуллаштыра, фаза аерылуын көчәйтә һәм мембрана деформациясенә һәм интернализациясенә китерә (44). Ивабучи һ.б. (43) Озын (C24), ләкин кыска (C16) булмаган ацил чылбырлары булганда, GSL лактозилцерамидына бәйләнгән күпвалентлы лиганд зур кластерлар барлыкка килүенә һәм мембрана инвагинациясенә китерә, һәм цитоплазмада Lyn аша сигнал трансдукциясе бәйләнгән нейтрофилларда ацил чылбырлары белән үзара бәйләнештә була.
Имезүчеләрнең поляризацияләнгән эпителий күзәнәкләрендә, анти-Гольджи челтәренең (TGN) апикаль плазма мембранасы дәрәҗәсенә концентрациясе GPI-AP аерылуын һәм сортлануын контрольдә тота (10, 45). Бу агрегация GPI-AP олигомеризациясе белән бәйле (36), ләкин ул шулай ук ​​чүпрәдә очрый торган керамид чылбыры озынлыгына да бәйле булырга мөмкин. Имезүчеләрнең GPI-AP эфир липид нигезендәге якорьга ия булса да һәм аның химик структурасы бик озын ацил чылбырлы керамидтан бик нык аерылып торса да, күптән түгел үткәрелгән тикшеренүләр ике липидның да эволюцион яктан охшаш физик һәм химик үзлекләргә һәм функциягә ия булуын күрсәтте (40). Шуңа күрә, имезүчеләр күзәнәкләрендәге эфир липид өлеше чүпрәдәге C26 керамидына охшаш булырга мөмкин, һәм аның роле - мембранадагы озын чылбырлы керамид белән бәйләнештә булып, GPI-AP агрегациясен һәм сортлануын стимуллаштыру. Бу мөмкинлекне турыдан-туры сынап карарга кирәк булса да, алдагы ачышлар озын ацил чылбырлы керамидның Гольджи җисеменә ташылуы цитоплазматик күчерү аксымнары белән башкарылмавын, ә чүпрә кебек GPI якорьларының синтезына бәйле булуын раслый. Шуңа күрә, эволюцион консерватив механизм бик озын ацил чылбырлы керамидны һәм GPI-APны (13, 16, 20, 46, 47) бер үк транспорт везикуласында сайлап бергә ташый ала кебек.
Чүпрә һәм имезүчеләрнең поляризацияләнгән эпителиаль күзәнәк системаларында GPI-AP агрегациясе һәм башка плазма мембранасы аксымнарыннан аерылуы күзәнәк өслегенә җиткәнче була. Паладино һ.б. (48) имезүчеләрнең поляризацияләнгән эпителиаль күзәнәкләренең TGN'ында GPI-AP кластерлашуы GPI-AP'ларның апикаль плазма мембранасына сайлап классификацияләнүе өчен генә түгел, ә GPI-AP'ларның кластерлашу оешмасын һәм аның биологик активлыгын да көйли икәнен ачыкладылар. Күзәнәк өслеге. Чүпрәдә бу тикшеренү ER'дагы C26 керамидына бәйле GPI-AP кластеры плазма мембранасындагы GPI-AP кластерлашу оешмасын һәм функциональ активлыгын көйли алуын күрсәтте (24, 49). Бу модельгә туры китереп, GhLag1 күзәнәкләре GPI ингибиторларына яки күзәнәк тышчасы бөтенлегенә тәэсир итүче препаратларга аллергияле (28), һәм чүпрә күзәнәкләре кушылуында проекцияләнгән оч керамидының функциональ Gas1-GFP кластерларына ихтыяҗ (49) G'ны күрсәтә hLag1 күзәнәкләренең мөмкин булган физиологик нәтиҗәләре. GPI-AP хатасы. Шулай да, күзәнәк өслегенең функциональ оешмасы липид озынлыгына нигезләнгән сортлау ысулы белән ЭРдан программалаштырылганмы-юкмы икәнен алга таба тикшерү безнең киләчәк тикшеренүләребезнең темасы булачак.
Бу эштә кулланылган Saccharomyces cerevisiae штаммнары S1 таблицасында күрсәтелгән. Тере күзәнәк сурәтләү өчен SCLIMның MMY1583 һәм MMY1635 штаммнары W303 фонында төзелгән. Флуоресцент аксым билгесе белән Sec13-mCherry экспрессияләүче бу штаммнар полимераз чылбыр реакциясе (ПЦР) нигезендә pFA6a плазмидасы шаблон буларак (23) кулланып төзелгән. GAL1 промоторы контролендә флуоресцент аксым белән билгеләнгән Mid2-iRFP экспрессияләүче штамм түбәндәгечә төзелгән. pKTiRFP-KAN векторыннан iRFP-KanMx эзлеклелегенең ПЦР көчәйтелүе (E. O'Shea бүләге, Addgene плазмид номеры 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; тикшеренү ресурслары идентификаторы (RRID): Addgene_64687) Һәм эндоген Mid2-ның С-терминалына кертелгән. Mid2-iRFP геном эзлеклелеге көчәйтелгәннән һәм GAL1 промоторына клонлаштырылганнан соң, ул pRS306 интеграция плазмидасы Not I-Sac I урынына интеграцияләнде. Нәтиҗәдә барлыкка килгән pRGS7 плазмиды URA3 локусына интеграцияләнер өчен Pst I белән сызыклаштырылды.
Gas1-GFP кушылу гены центромера (CEN) плазмидасында GAL1 промоторы контроле астында экспрессияләнә, ул түбәндәгечә төзелгән. Gas1-GFP эзлеклелеге pRS416-GAS1-GFP плазмидыннан (24) (Л. Пополо бүләге) ПЦР ярдәмендә көчәйтелгән һәм CEN плазмидасы pBEVY-GL LEU2 (C бүләге) Xma I–Xho I урынына клонлаштырылган. Миллер; Адджен плазмидасы номеры 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Нәтиҗәдә барлыкка килгән плазмид pRGS6 дип аталган. Axl2-GFP кушылу гены шулай ук ​​pBEVY-GL LEU2 векторының GAL1 промоторы контроле астында экспрессияләнә, һәм аның төзелеше түбәндәгечә. Axl2-GFP эзлеклелеге pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмидыннан (23) ПЦР ярдәмендә көчәйтелде һәм pBEVY-GL LEU2 векторының Bam HI-Pst I урынына клонлаштырылды. Нәтиҗәдә барлыкка килгән плазмид pRGS12 дип аталды. Бу тикшеренүдә кулланылган олигонуклеотидлар эзлеклелеге S2 таблицасында күрсәтелгән.
Штаммга углерод чыганагы буларак 0,2% аденин һәм 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-рафиноза] белән бай чүпрә экстракты аксымы p (YP) мохите (1% чүпрә экстракты һәм 2% аксым ept). (YPR)] яки 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] кушылды, яки туклану өчен кирәкле аминокислоталар һәм нигезләрне тулыландыру өчен синтетик минималь мохиттә (0,15% чүпрә азот нигезе һәм 0,5% аммоний сульфаты) кулланылды, һәм углерод чыганагы буларак 2% глюкоза (синтетик глюкоза минималь мохите) яки 2% галактоза (синтетик галактоза минималь мохите) кулланылды.
Реаль вакыт режимында сурәтләү өчен, GAL1 промоторы астында конструкцияне экспрессияләүче температурага сизгер sec31-1 мутант күзәнәкләре YPR мохитендә 24°C температурада төн уртасына кадәр үстерелде. YPGда 24°C температурада 1 сәгать индукцияләнгәннән соң, күзәнәкләр SGда 37°C температурада 30 минут инкубацияләнде, аннары секреция блогыннан чыгару өчен 24°C температурага күчерелде. Конканавалин А күзәнәкләрне пыяла слайдка беркетү һәм SCLIM ярдәмендә сурәтләү өчен кулланылды. SCLIM - Olympus IX-71 инверсияләнгән флуоресценция микроскобы һәм UPlanSApo 100×1.4 санлы диафрагма майлы линзасы (Olympus), югары тизлекле һәм югары сигнал-шау-шу нисбәте булган әйләнүче диск конфокаль сканеры (Yokogawa Electric), махсус спектрометр һәм махсус суыту җайланмаларының кушылмасы. Системаның сурәт көчәйткече (Hamamatsu Photonics) ×266.7 зурайту белән зурайту линзасы системасын һәм электроннарны тапкырлаучы зарядка тоташтырылган җайланма камерасын (Hamamatsu Photonics) тәэмин итә ала (21). Рәсем алу махсус программа тәэминаты (Yokogawa Electric) ярдәмендә башкарыла. 3D сурәтләр өчен без объектив линзаны вертикаль рәвештә тибрәтер өчен махсус ясалган пьезоэлектрик актуатор кулландык һәм оптик өлешләрне 100 нм ара белән бер катламга җыйдык. Z-катлам сурәте 3D воксель мәгълүматларына әйләндерелә, ә әйләнүче диск конфокаль микроскобы өчен кулланылган теоретик нокта таралу функциясе Volocity программа тәэминаты (PerkinElmer) ярдәмендә деконволюция эшкәртү өчен кулланыла. Volocity программасын кулланып, бергә урнашу анализы өчен автоматик рәвештә бусаганы билгеләү юлы белән, йөкне дә кертеп, ERES үлчәнде. Сызыкларны сканерлау анализы MetaMorph (Molecular Devices) программасын кулланып башкарылды.
Статистик әһәмиятне билгеләү өчен GraphPad Prism программасын кулланыгыз. Ике яклы Стьюдент t-тестында һәм гадәти бер яклы дисперсия анализы (ANOVA) тестында төркемнәр арасындагы аермалар P <0,05 (*) га зур йогынты ясый дип санала.
Gas1-GFP флуоресценция микроскопиясе өчен, логарифм фазасы күзәнәкләре YPDда төнлә үстерелде һәм центрифугалау юлы белән җыелды, фосфат буферы белән ике тапкыр юылды һәм бозда ким дигәндә 15 минут инкубацияләнде, аннары микроскоп астында элек тасвирланганча дәвам иттерелде (24). Алу өчен объектив линза, L5 (GFP) фильтры, Hamamatsu камерасы һәм Application Suite X (LAS X) программасы белән җиһазландырылган Leica DMi8 микроскопы (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) кулланылды.
Үрнәкләр SDS үрнәк буферы белән 65°C температурада 10 минут денатурацияләнде, аннары SDS-полиакриламид геле электрофорезы (PAGE) ярдәмендә аерылды. Иммуноблоттинг анализы өчен һәр полосага 10 мкл үрнәк салынды. Беренчел антитәнчек: 1:3000 сыекландыруда куян поликлональ анти-Gas1, 1:500 сыекландыруда куян поликлональ анти-Emp24 һәм 1:3000 сыекландыруда куян поликлональ анти-GFP (Х. Ризман бүләге) кулланыгыз. 1:5000 сыекландыруда тычкан моноклональ анти-Pgk1 антитәнчеге кулланылды (Дж. де ла Круз бүләге). Икенчел антитәнчек: 1:3000 сыекландыруда кулланылган хрен пероксидазасы (HRP) белән конъюгацияләнгән кәҗә анти-куян иммуноглобулины G (IgG) (Пирс). HRP белән конъюгацияләнгән кәҗә тычканнарына каршы IgG 1:3000 нисбәтендә сыекландырылып кулланылды (Пирс). Иммун җавап зонасы SuperSignal West Pico реактивының (Thermo Fisher Scientific) хемилюминесценция ысулы белән күзәтелде.
(31)дә тасвирланганча, баетылган ER фракциясендә табигый иммунопреципитация эксперименты үткәрелде. Кыскасы, чүпрә күзәнәкләрен TNE буферы [50 мМ трис-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид һәм протеаза ингибиторы катнашмасы) белән 600 нм (OD600) 100 оптик тыгызлыкта ике тапкыр юыгыз. Ул пыяла шарчыклар белән ватылды, аннары күзәнәк калдыклары һәм пыяла шарчыклар центрифугалау юлы белән алынды. Аннары өслек катламы 17,000 г тизлектә 4°C температурада 15 минут дәвамында центрифугаланды. Гранула TNEда яңадан суспензияләнде һәм дигиталис сапонины 1% соңгы концентрациягә кадәр өстәлде. Суспензия 4°C температурада әйләндереп 1 сәгать инкубацияләнде, аннары эремәгән компонентлар 13,000 г тизлектә 4°C температурада 60 минут дәвамында центрифугалау юлы белән алынды. Gas1-GFP иммунопреципитациясе өчен, башта үрнәкне буш агароза бөртекләре (ChromoTek) белән 4°C температурада 1 сәгать алдан инкубацияләгез, аннары GFP-Trap_A (ChromoTek) белән 4°C температурада 3 сәгать инкубацияләгез. Иммунопреципитацияләнгән бөртекләр биш тапкыр 0,2% дигоксигенинлы TNE белән юылды, SDS үрнәк буферы белән элюцияләнде, SDS-PAGE'та аерылды һәм иммуноблоттинг ярдәмендә анализланды.
(31)дә тасвирланганча, баетылган ЭР фракциясендә кросс-бәйләү билгеләү башкарылды. Кыскасы, баетылган ЭР фракциясе 0,5 мМ дитиобис (сукцинимидил пропионат) белән инкубацияләнде (Пирс, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, АКШ; 20°C, 20 мин). Кросс-бәйләү реакциясе глицин өстәп сүндерелде (50 мМ соңгы концентрация, 5 минут, 20°C).
Элегрәк тасвирланганча (50), кыргый типтагы һәм GhLag1 штаммнарындагы керамидның MS анализы үткәрелде. Кыскасы, күзәнәкләр 30°C температурада YPDда экспоненциаль фазага кадәр (3-4 OD600 берәмлек/мл) үстерелде, һәм 25×107 күзәнәк җыелды. Аларның метаболизмы трихлорсерке кислотасы белән сүндерелә. Экстракция эреткечен [этанол, су, эфир, пиридин һәм 4,2 Н аммоний гидроксиды (15:15:5:1:0,018 v/v)] һәм эчке стандарт C17 керамидының 1,2 нмоль (860517, Avanti поляр липид) сыйфатын кулланыгыз. Экстрактның җиңел селте гидролизын башкару өчен монометиламин реагентын [метанол, су, n-бутанол һәм метиламин эремәсе (4:3:1:5 v/v)] кулланыгыз, аннары тозсызландыру өчен су белән туендырылган n-бутанол кулланыгыз. Ниһаять, экстракт уңай режимдагы эреткечтә [хлороформ/метанол/су (2:7:1) + 5 мМ аммоний ацетаты] кабат эретелде һәм масса-спектрометрга кертелде. Сфинголипид молекулаларын идентификацияләү һәм санлаштыру өчен күп реакцияле мониторинг (MRM) үткәрелде. TSQ Vantage өченчел квадруполь масса-спектрометры (Thermo Fisher Scientific) липид анализы өчен робот нанофлюжный ион чыганагы Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Нью-Йорк) белән җиһазландырылган. Бәрелеш энергиясе һәр керамид категориясе өчен оптимальләштерелгән. MS мәгълүматлары уңай режимда алынган. Һәр биологик кабатлау өчен липид сигналы өч бәйсез үлчәүнең медианасы булып тора.
(31) пунктында тасвирланганча, Gas1-GFP экспрессияләүче күзәнәкләр (800 × 107) табигый иммунопреципитациягә дучар ителде. Чистартылган Gas1-GFP SDS-PAGE ярдәмендә аерылды һәм поливинилиден фторид (PVDF) мембранасына күчерелде. Аксым PVDFны амид карасы белән буяу юлы белән күрсәтелде. Gas1-GFP тасмасы PVDFтан киселде һәм 5 тапкыр метанол белән, бер тапкыр сыек хроматография-MS (LC-MS) класслы су белән юылды. Мембрана тасмасын 500 мкл 0,3 М NaOAc (рН 4,0), буфер һәм 500 мкл яңа эретелгән 1 М натрий нитрит катнашмасы белән 37°C температурада 3 сәгать инкубацияләү юлы белән липид фракциясе Gas1-GFPдан чыгарыла һәм лизислана. Глюкозамин һәм инозитол арасында инозин фосфат керамидының чыгарылуы (51). Шуннан соң, мембрана тасмасы LC-MS класслы су белән дүрт тапкыр юылды, бүлмә температурасында киптерелде һәм анализга кадәр -80°C температурада азот атмосферасында сакланды. Контроль буларак, һәр эксперимент өчен PVDF мембранасының буш үрнәге кулланылды. Аннары Gas1-GFP'тан алынган липид (50) тасвирланганча MS ярдәмендә анализланды. Кыскасы, GPI-липидлы PVDF тасмалары 75 мкл тискәре калып эреткече [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммоний ацетаты] эчендә яңадан эретелде һәм сфинголипид төрләренең электроспрей ионизациясе (ESI)-MRM/MS анализыннан үтте (TSQ Vantage). Бу очракта MS мәгълүматлары тискәре ион режимында алынды.
Алдан әйтелгәнчә, GPI якоренең липид өлеше [3H]-инозитол белән билгеләнгән GPI-AP'тан аерылды (16). Липидлар эреткеч системасы (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) ярдәмендә юка катламлы хроматография ярдәмендә аерылды һәм FLA-7000 (Fujifilm) ярдәмендә визуализацияләнде.
Gas1-GFP (600 × 107) экспрессияләүче күзәнәкләр TNE буферы белән ике тапкыр юылды, пыяла шарчыклар белән ватылды, аннары күзәнәк калдыкларын һәм шарчыкларны бетерү өчен центрифугаланды. Аннары өслек катламы 17000 g температурада 4°C температурада 1 сәгать дәвамында центрифугаланды. Грунт TNE температурада юылды һәм 37°C температурада 1 сәгать дәвамында 0,2% дигиталис сапонины булган TNE температурада 1 U PI-PLC (Invitrogen) белән инкубацияләнде. Фермент белән эшкәртелгәннән соң, мембрана 17000 g температурада 4°C температурада 1 сәгать дәвамында центрифугалау юлы белән алынды. Gas1-GFP иммунопреципитацияләү өчен, өслек катламы 4°C температурада төнлә GFP-Trap_A (ChromoTek) белән инкубацияләнде. SDS-PAGE белән аерылган чистартылган Gas1-GFP Кумасси бриллиант зәңгәре белән буялды. Gas1-GFP буяу полосасы суүткәргеч тирәсендәге соры төстән киселде, аннары йодоацетамид белән алкиллаштыру һәм дитиотреитол белән редукцияләүдән соң, трипсин белән гель эчендә эшкәртү башкарылды. Экстракт һәм коры триптик пептидлар һәм пептидлар GPI-гликаннар белән алынды. Киптерелгән пептид 20 мкл суда эретелде. Бер порция (8 мкл) LCга кертелде. Билгеле бер градиент шартларында пептидларны аеру өчен октадецилсилан (ODS) колонкасы (Develosil 300ODS-HG-5; эчке диаметры 150 мм × 1,0 мм; Nomura Chemical, Айчи префектурасы, Япония) кулланылды. Күчмә фаза - эреткеч А (0,08% кумырска кислотасы) һәм эреткеч В (0,15% кумырска кислотасы 80% ацетонитрилда). Accela HPLC системасы (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс) колонканы А эреткече белән 55 минут эчендә 50 мкл мин-1 агым тизлегендә элюцияләү өчен кулланылды, аннары В эреткече концентрациясе 40% ка кадәр арттырылды. , АКШ). Элюат ESI ион чыганагына өзлексез кертелде, һәм триптик пептидлар һәм GPI-гликаннары булган пептидлар LTQ Orbitrap XL (гибрид сызыклы ион тозагы-орбитрап масса-спектрометры; Thermo Fisher Scientific) ярдәмендә анализланды. MS җайланмасында капилляр чыганагының көчәнеше 4,5 кВ итеп билгеләнде, ә күчерү капиллярының температурасы 300°C температурада тотылды. Капилляр көчәнеше һәм трубка линзасы көчәнеше тиешенчә 15 В һәм 50 В итеп билгеләнде. MS мәгълүматлары уңай ион режимында (чишелеш 60,000; масса төгәллеге миллионга 10 өлеш) 300/м/з масса/заряд нисбәте (м/з) 3000 масса диапазонында алынган. MS/MS мәгълүматлары LTQ Orbitrap XL'дагы ион тозагы аша алынган [мәгълүматлар бәйле булган беренче 3 сан, бәрелештән килеп чыккан диссоциация (CID)].
MD симуляцияләре GROMACS (52) программасы һәм MARTINI 2 көч кыры (53-55) ярдәмендә башкарылды. Аннары CHARMM GUI мембрана төзүчесе (56, 57) диолеойлфосфатидилхолин (DOPC) һәм Cer C18 яки DOPC һәм Cer C26 булган ике катламлы катлам төзү өчен кулланылды. Cer C26 топологиясе һәм координаталары DXCE'дан сфингозин койрыгыннан өстәмә бөртекләрне алып ташлау юлы белән алына. Икеләтә катламны тигезләү һәм аны эшләтеп җибәрү өчен түбәндә тасвирланган процессны кулланыгыз, аннары Emp24 булган система төзү өчен системаның соңгы координаталарын кулланыгыз. Emp24 чүпрәсенең трансмембран домены (173 - 193 калдыклары) визуаль MD (VMD) коралы молекуляр структурасын кулланып α-спираль рәвешендә төзелде (58). Аннары, капланган липидларны алып ташлаганнан соң, аксым эре гранулалаштырылды һәм CHARMM GUI кулланып ике катламлы катламга кертелде. Соңгы системада 1202 DOPC һәм 302 Cer C26 яки 1197 DOPC һәм 295 Cer C18 һәм Emp24 бар. Системаны 0,150 М концентрациясенә кадәр ионлаштырыгыз. Ике ике катламлы композиция өчен дүрт бәйсез кабатлау ясалды.
Липид ике катламы CHARMM GUI процессы ярдәмендә баланслана, ул 405,000 адымны минимальләштерүне һәм аннары баланслауны үз эченә ала, анда позиция чикләүләре әкренләп кими һәм бетерелә, ә вакыт адымы 0,005 ps тан 0,02 ps ка кадәр арта. Тигезләнгәннән соң, ул 0,02 ps вакыт адымы белән 6 мкс җитештерә. Emp24 керткәннән соң, системаны минимальләштерү һәм баланслау өчен шул ук CHARMM GUI процессын кулланыгыз, аннары җитештерүдә 8 секунд эшләгез.
Барлык системалар өчен дә, баланслаштыру процессында басым Берендсен баростаты (59) белән контрольдә тотыла, ә җитештерү процессында басым Парринелло-Рахман баростаты (60) белән контрольдә тотыла. Барлык очракларда да уртача басым 1 бар тәшкил итә һәм ярымизотроп басым тоташтыру схемасы кулланыла. Баланслау һәм җитештерү процессында тизлекне яңадан калибрлау белән термостат (61) аксым, липид һәм эреткеч кисәкчәләренең температурасын тоташтыру өчен кулланыла. Бөтен эш барышында максатчан температура 310К тәшкил итә. Бәйләнешсез үзара бәйләнеш 0,005 буфер толерантлыгы белән Верлет схемасын кулланып парлаштыру исемлеген булдыру юлы белән исәпләнә. Кулон термины реакция кыры һәм 1,1 нм кисү аралыгы ярдәмендә исәпләнә. Вандер Ваальс термины 1,1 нм кисү аралыгы белән кисү схемасын куллана, ә Верлет кисү схемасы потенциаль дрейф өчен кулланыла (62).
VMD кулланып, DOPC фосфат бөртекләре яки керамид AM1 бөртекләре белән аксым арасындагы кисү дулкын озынлыгы 0,7 нм тәшкил итә, һәм аксым белән үзара бәйләнештә булган липидлар саны исәпләнә. Түбәндәге формула буенча, (63) формуласындагы кебек, кимү-баету (DE) коэффициентын исәпләгез: DE факторы = (аксымдагы гомуми липидлар күләме 0,7) аксымдагы 0,7 (барлык липидлардагы Cer күләме)
Күрсәтелгән кыйммәт уртача буларак алына, ә хата полосалары SE-ның дүрт бәйсез күчермәсе. DE факторының статистик әһәмияте t тесты [(уртача DE-фактор-1)/SE] ярдәмендә исәпләнә. Берьяклы бүленештән P кыйммәтен исәпләгез.
GROMACS коралы соңгы 250 н эчендә Emp24 булган системаның 2D ян тыгызлык картасын исәпләү өчен кулланылды. Керамидның баету/кимеү картасын алу өчен, Cer тыгызлык картасы Cer һәм DOPC картасы суммасына, аннары тәндәге Cer концентрациясенә бүленә. Шул ук төсле карта масштабы кулланыла.
Бу мәкалә өчен өстәмә материаллар белән танышу өчен, зинһар, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 сылтамасын карагыз.
Бу - Creative Commons Attribution-Nocommercial License шартлары нигезендә таратылган ачык керү мөмкинлеге булган мәкалә, ул теләсә нинди материалда кулланырга, таратырга һәм күчереп алырга мөмкинлек бирә, ләкин соңгы куллану коммерция максатларында булмаган һәм төп эш дөрес булган очракта. Сылтама.
Искәрмә: Без сездән электрон почта адресыгызны гына сорыйбыз, шуңа күрә сез биткә тәкъдим иткән кеше сезнең электрон хатны күрүен теләвегезне һәм аның спам түгеллеген белсен. Без бернинди электрон почта адресларын да теркәмәячәкбез.
Бу сорау сезнең кунак булу-булмавыгызны тикшерү һәм спамның автоматик рәвештә җибәрелүен булдырмау өчен кулланыла.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Атсуко Икеда (Атсуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Оксилиадора Агилера Марегера Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Про Акира, Стефано Фэнни, Акихико Накано, Мануэль Муниз
3D югары сыйфатлы реаль вакыт режимындагы сурәтләү, сайлап алынган чыгару урыннарында аксымнарны сортлау өчен керамид чылбыры озынлыгының мөһимлеген күрсәтә.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Атсуко Икеда (Атсуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Оксилиадора Агилера Марегера Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Про Акира, Стефано Фэнни, Акихико Накано, Мануэль Муниз
3D югары сыйфатлы реаль вакыт режимындагы сурәтләү, сайлап алынган чыгару урыннарында аксымнарны сортлау өчен керамид чылбыры озынлыгының мөһимлеген күрсәтә.
© 2020 Фән үсеше өчен Америка Ассоциациясе. барлык хокуклар сакланган. AAAS - HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef һәм COUNTER партнеры. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.