Элегрәк без бавыр фиброзы белән авыручыларда эчәклектән алынган триптофан метаболиты индол-3-пропион кислотасының (IPA) сыворотка дәрәҗәсе түбәнрәк булуы турында хәбәр иткән идек. Бу тикшеренүдә без симез бавырларда транскриптомны һәм ДНК метиломын сыворотка IPA дәрәҗәләре белән бәйләп тикшердек, шулай ук ​​IPAның in vitro шартларында бавыр йолдызча күзәнәкләренең (HSCs) фенотипик инактивациясен индукцияләүдәге ролен тикшердек.
Тикшеренүгә Куопио Бариатрик Хирургия Үзәгендә (KOBS) бариатрик хирургия ясаткан 2 типтагы шикәр диабеты (2 нче типтагы шикәр диабеты) булмаган 116 симез пациент (яшь 46,8 ± 9,3 яшь; БМИ: 42,7 ± 5,0 кг/м²) кертелгән. Циркуляциядәге IPA дәрәҗәләре сыек хроматография-масса спектрометриясе (LC-MS) ярдәмендә үлчәнгән, бавыр транскриптом анализы гомуми РНК секвенирлавы ярдәмендә үткәрелгән, ә ДНК метиллашу анализы Infinium HumanMethylation450 BeadChip кулланып үткәрелгән. In vitro экспериментлар өчен кеше бавырының йолдызсыман күзәнәкләре (LX-2) кулланылган.
Кан сывороткасындагы IPA дәрәҗәләре бавырның апоптоз, митофагия һәм озын гомерлелек юлларында катнашкан геннарның экспрессиясе белән корреляцияләнгән. AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) гены бавыр транскриптында һәм ДНК метилизациясе профильләрендә иң күп очрый торган һәм доминант үзара бәйләнештә булган ген булган. IPA белән дәвалау апоптозны китереп чыгарган, митохондриаль сулыш алуны киметкән һәм LX-2 күзәнәкләренең фиброзын, апоптозын һәм яшәүне көйли торган геннар экспрессиясен модуляцияләү юлы белән күзәнәк морфологиясен һәм митохондриаль динамикасын үзгәрткән.
Гомумән алганда, бу мәгълүматлар IPA потенциаль терапевтик эффектларга ия булуын һәм апоптозны стимуллаштыра һәм HSC фенотипын актив булмаган хәлгә күчерә алуын раслый, шуның белән HSC активациясенә һәм митохондриаль метаболизмга комачаулап, бавыр фиброзын тоткарлау мөмкинлеген киңәйтә.
Симерү һәм метаболик синдром таралуы метаболик яктан бәйле майлы бавыр авыруы (MASLD) очракларының артуы белән бәйле; бу авыру гомуми халыкның 25% тан 30% ка кадәр тәэсир итә [1]. MASLD этиологиясенең төп нәтиҗәсе - бавыр фиброзы, ул фиброзлы күзәнәк тышча матрицасының (ECM) өзлексез туплануы белән характерланган динамик процесс [2]. Бавыр фиброзы белән бәйле төп күзәнәкләр - бавыр йолдызсыман күзәнәкләре (HSCs), алар дүрт билгеле фенотип күрсәтәләр: тыныч, активлаштырылган, активлаштырылмаган һәм картаючы [3, 4]. HSCs активлашырга һәм тыныч формадан югары энергия таләп итүче пролифератив фибробластсыман күзәнәкләргә трансдифференциацияләнергә мөмкин, α-шома мускул актинының (α-SMA) һәм I тип коллагенның (Col-I) экспрессиясе арту белән [5, 6]. Бавыр фиброзы кире кайтуы вакытында активлаштырылган HSCs апоптоз яки инактивация аша бетерелә. Бу процессларга фиброген геннарның кимүе һәм просурвиваль геннарның модуляциясе (мәсәлән, NF-κB һәм PI3K/Akt сигнал юллары) [7, 8], шулай ук ​​митохондриаль динамика һәм функциядәге үзгәрешләр керә [9].
Эчәктә җитештерелә торган триптофан метаболиты индол-3-пропион кислотасының (IPA) кан сарысуындагы дәрәҗәсе кеше метаболик авыруларында, шул исәптән MASLDда да кимүе ачыкланган [10–13]. IPA азык җепселләрен куллану белән бәйле, антиоксидант һәм ялкынсынуга каршы тәэсире белән билгеле, һәм диета китереп чыгарган алкогольсез стеатогепатит (NASH) фенотипын in vivo һәм in vitro шартларында киметә [11–14]. Кайбер дәлилләр безнең алдагы тикшеренүдән алынган, алар Куопио бариатрик хирургия тикшеренүендә (KOBS) бавыр фиброзы булган пациентларда кан сарысуындагы IPA дәрәҗәсе бавыр фиброзы булмаган симез пациентларга караганда түбәнрәк булуын күрсәткән. Моннан тыш, без IPA белән дәвалау кеше бавыр йолдызча күзәнәге (LX-2) моделендә күзәнәк адгезиясенең, күзәнәк миграциясенең һәм гемопоэтик күзәнәк активлашуының классик маркерлары булган геннарның экспрессиясен киметергә мөмкин һәм потенциаль гепатопротектор метаболит булып тора [15]. Шулай да, IPA HSC апоптозын һәм митохондриаль биоэнергетиканы активлаштыру юлы белән бавыр фиброзы регрессиясен ничек китереп чыгаруы ачык түгел.
Монда без сыворотка IPA-ның симез, ләкин 2 нче типтагы диабет (KOBS) булмаган кешеләрнең бавырында апоптоз, митофагия һәм озын гомерлелек юллары белән байытылган геннар экспрессиясе белән бәйле булуын күрсәтәбез. Моннан тыш, без IPA-ның активлаштырылган гемопоэтик күзәнәкләрнең (HSC) активлашуын һәм таркалуын инактивация юлы аша стимуллаштыра алуын ачыкладык. Бу нәтиҗәләр IPA-ның яңа ролен ача, аны бавыр фиброзы регрессиясен стимуллаштыру өчен потенциаль терапевтик максат итә.
KOBS когортасында узган алдагы тикшеренү бавыр фиброзы белән авыручыларның канында IPA дәрәҗәләренең бавыр фиброзы булмаган пациентлар белән чагыштырганда түбәнрәк булуын күрсәтте [15]. 2 нче типтагы диабетның потенциаль контраст эффектын чыгарып ташлау өчен, без KOBS тикшеренүеннән 2 нче типтагы диабетсыз 116 симез пациентны (уртача яшь ± SD: 46,8 ± 9,3 яшь; BMI: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (1 нче таблица) тикшеренү популяциясе буларак җыйдык [16]. Барлык катнашучылар да язмача ризалык бирделәр һәм тикшеренү протоколы Төньяк Саво округы хастаханәсенең Этика комитеты тарафыннан Хельсинки декларациясенә (54/2005, 104/2008 һәм 27/2010) туры китереп расланды.
Бавыр биопсиясе үрнәкләре бариатрик хирургия вакытында алынды һәм тәҗрибәле патологоанатомнар тарафыннан алдан тасвирланган критерийлар буенча гистологик яктан бәяләнде [17, 18]. Бәяләү критерийлары S1 өстәмә таблицасында кыскача күрсәтелгән һәм элегрәк тасвирланган [19].
Ач карын сыворотка үрнәкләре метаболомика анализы өчен максатчан булмаган сыек хроматография-масса спектрометриясе (LC-MS) ярдәмендә анализланды (n = 116). Үрнәкләр элек тасвирланганча UHPLC-qTOF-MS системасы (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Германия) ярдәмендә анализланды19. Изопропил спиртын (IPA) билгеләү саклау вакытына һәм MS/MS спектрын саф стандартлар белән чагыштыруга нигезләнгән. IPA сигнал интенсивлыгы (пик мәйданы) барлык алдагы анализларда да исәпкә алынган [20].
Бөтен бавыр РНК секвенирлавы Illumina HiSeq 2500 ярдәмендә башкарылды һәм мәгълүматлар алдан тасвирланганча эшкәртелде [19, 21, 22]. Без MitoMiner 4.0 мәгълүматлар базасыннан сайланган 1957 генны кулланып, митохондриаль функциягә/биогенезга тәэсир итүче транскриптларның максатчан дифференциаль экспрессия анализын үткәрдек [23]. Бавыр ДНКсы метилляциясе анализы Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, АКШ) ярдәмендә алдан тасвирланган методология ярдәмендә башкарылды [24, 25].
Кеше бавырының йолдызсыман күзәнәкләре (LX-2) профессор Стефано Ромео тарафыннан бирелгән һәм DMEM/F12 мохитендә (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) үстерелгән һәм сакланган. IPA эш дозасын сайлау өчен, LX-2 күзәнәкләре DMEM/F12 мохитендә 24 сәгать дәвамында төрле концентрациядәге IPA (10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ; Sigma, 220027) белән эшкәртелгән. Моннан тыш, IPAның HSCларны инактивлаштыру сәләтен тикшерү өчен, LX-2 күзәнәкләре сывороткасыз мохиттә 24 сәгать дәвамында 5 нг/мл TGF-β1 (R&D системалары, 240-B-002/CF) һәм 1 мМ IPA белән бергә эшкәртелгән. Тиешле транспорт чарасы контроле өчен, TGF-β1 белән дәвалау өчен 0,1% BSA булган 4 нМ HCL һәм IPA белән дәвалау өчен 0,05% DMSO кулланылды, һәм икесе дә комбинацияләнгән дәвалау өчен бергә кулланылды.
Апоптоз җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, FITC Annexin V апоптозны ачыклау комплекты белән 7-AAD (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, АКШ, Cat# 640922) ярдәмендә бәяләнде. Кыскасы, LX-2 (1 × 105 күзәнәк/чок) төн буе 12 чокулы пластиналарда үстерелде, аннары IPA яки IPA һәм TGF-β1ның күп дозалары белән эшкәртелде. Икенче көнне йөзүче һәм ябышучы күзәнәкләр җыелды, трипсинлаштырылды, PBS белән юылды, Annexin V бәйләү буферында кабат суспензияләнде һәм FITC-Annexin V һәм 7-AAD белән 15 минут инкубацияләнде.
Тере күзәнәкләрдәге митохондрияләр Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) кулланып оксидлашу активлыгы өчен буялды. MTR анализлары өчен LX-2 күзәнәкләре IPA һәм TGF-β1 белән тигез тыгызлыкта инкубацияләнде. 24 сәгатьтән соң тере күзәнәкләр трипсинлаштырылды, PBS белән юылды, аннары 100 мкМ MTR белән сывороткасыз мохиттә 37 °C температурада 20 минут дәвамында инкубацияләнде, алдан тасвирланганча [26]. Тере күзәнәк морфологиясен анализлау өчен, күзәнәк зурлыгы һәм цитоплазманың катлаулылыгы алга таралу (FSC) һәм ян таралу (SSC) параметрлары ярдәмендә анализланды.
Барлык мәгълүматлар (30,000 вакыйга) NovoCyte Quanteon (Agilent) ярдәмендә алынды һәм NovoExpress® 1.4.1 яки FlowJo V.10 программасы ярдәмендә анализланды.
Кислород куллану тизлеге (OCR) һәм күзәнәктән тыш кислоталашу тизлеге (ECAR) җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, Seahorse XF Cell Mito Stress белән җиһазландырылган Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ярдәмендә реаль вакыт режимында үлчәнде. Кыскасы, 2 × 104 LX-2 күзәнәк/кое XF96 күзәнәк культурасы пластиналарына чәчелде. Төнлә инкубациядән соң, күзәнәкләр изопропанол (IPA) һәм TGF-β1 белән эшкәртелде (Өстәмә ысуллар 1). Мәгълүматлар анализы Seahorse XF Wave программасы ярдәмендә башкарылды, анда Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator керә. Шуннан чыгып, Биоэнергетик Сәламәтлек Индексы (BHI) исәпләнде [27].
Гомуми РНК кДНКга күчерелде. Конкрет ысуллар өчен [15] сылтамасын карагыз. Кешенең 60S рибосомаль кислота аксымы P0 (RPLP0) һәм циклофилин A1 (PPIA) мРНК дәрәҗәләре конститутив ген контроле буларак кулланылды. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR системасы (Thermo Fisher, Landsmeer, Нидерландлар) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) яки Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) белән кулланылды, һәм чагыштырма ген экспрессиясе катламы чагыштырма Ct кыйммәте циклы параметрлары (ΔΔCt) һәм ∆∆Ct ысулы ярдәмендә исәпләнде. Праймерлар турында мәгълүмат S2 һәм S3 өстәмә таблицаларында бирелгән.
Атом ДНКсы (ncDNA) һәм митохондриаль ДНК (mtDNA), элегрәк тасвирланганча [28], DNeasy кан һәм тукыма комплекты (Qiagen) ярдәмендә алынды. mtDNAның чагыштырма күләме, 2 нче өстәмә ысулларда җентекләп аңлатылганча, һәр максатлы mtDNA өлкәсенең өч атом ДНК өлкәсенең (mtDNA/ncDNA) геометрик уртачасына нисбәтен исәпләп чыгарылды. mtDNA һәм ncDNA өчен праймерлар турында мәгълүмат S4 өстәмә таблицасында бирелгән.
Тере күзәнәкләр күзәнәкара һәм күзәнәк эчендәге митохондриаль челтәрләрне визуальләштерү өчен Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) белән буялды. LX-2 күзәнәкләре (1 × 104 күзәнәк/чок) пыяла слайдларда тиешле пыяла төпле культура пластиналарында (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Германия) үстерелде. 24 сәгатьтән соң, тере LX-2 күзәнәкләре 37 °C температурада 20 минут дәвамында 100 мкМ MTR белән инкубацияләнде һәм күзәнәк төшләре DAPI (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich) белән буялды, алдан тасвирланганча [29]. Митохондриаль челтәрләр Zeiss LSM 800 конфокаль модуле белән җиһазландырылган Zeiss Axio Observer инверсияләнгән микроскобы (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия) ярдәмендә 37 °C температурада 5% CO2 белән дымлы атмосферада 63 × NA 1.3 объектив ярдәмендә визуальләштерелде. Һәр үрнәк төре өчен без ун Z серияле рәсем алдык. Һәр Z сериясендә 30 кисем бар, һәрберсенең калынлыгы 9,86 мкм. Һәр үрнәк өчен ZEN 2009 программасы (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия) ярдәмендә ун төрле күрү кыры рәсемнәре алынды, ә митохондриаль морфология анализы 3 нче өстәмә ысулда җентекләп күрсәтелгән параметрларга туры китереп, ImageJ программасы (v1.54d) [30, 31] ярдәмендә башкарылды.
Күзәнәкләр 0,1 М фосфат буферында 2% глутаральдегид белән фиксацияләнде, аннары 1% осмий тетроксиды эремәсе белән фиксацияләнде (Sigma Aldrich, MO, АКШ), ацетон белән әкренләп киптерелде (Merck, Darmstadt, Германия) һәм ахырда эпоксид сумаласына салынды. Ультрафиолет кисемтәләр әзерләнде һәм 1% уранил ацетат (Merck, Darmstadt, Германия) һәм 1% кургаш цитраты (Merck, Darmstadt, Германия) белән буялды. Ультрафиолет рәсемнәре 80 кВ тизләткеч көчәнештә JEM 2100F EXII тапшыру электрон микроскобы (JEOL Ltd, Токио, Япония) ярдәмендә алынды.
24 сәгать дәвамында IPA белән эшкәртелгән LX-2 күзәнәкләренең морфологиясе Zeiss инверсияләнгән яктылык микроскопы (Zeiss Axio Vert.A1 һәм AxioCam MRm, Йена, Германия) ярдәмендә 50 тапкыр зурайтып фазалы-контрастлы микроскопия ярдәмендә анализланды.
Клиник мәгълүматлар уртача ± стандарт тайпылыш яки медиана (квартильара диапазон: IQR) рәвешендә күрсәтелде. Өч тикшеренү төркеме арасындагы аермаларны чагыштыру өчен дисперсиянең берьяклы анализы (өзлексез үзгәрүчәннәр) яки χ² тесты (категорик үзгәрүчәннәр) кулланылды. Күп санлы тестларны төзәтү өчен ялган уңай күрсәткеч (FDR) кулланылды, һәм FDR < 0,05 булган геннар статистик яктан әһәмиятле дип саналды. CpG ДНК метиллашуын IPA сигнал интенсивлыгы белән корреляцияләү өчен Спирман корреляциясе анализы кулланылды, номиналь p кыйммәтләре (p < 0,05) хәбәр ителде.
Юл анализы веб-нигезле геннар җыелмасын анализлау коралы (WebGestalt) ярдәмендә үткәрелде, анда 268 транскрипт (номиналь p < 0.01), 119 митохондрия белән бәйле транскрипт (номиналь p < 0.05) һәм кан сарысуындагы IPA дәрәҗәләре белән бәйле 3093 бавыр транскриптыннан 4350 CpG табылды. Ирекле кулланыла торган Venny DB (2.1.0 версиясе) коралы кабатланучы геннарны табу өчен кулланылды, ә StringDB (11.5 версиясе) аксым-аксым үзара бәйләнешен визуализацияләү өчен кулланылды.
LX-2 эксперименты өчен үрнәкләр нормальлеккә Д'Агостино-Пирсон тесты ярдәмендә тикшерелде. Мәгълүматлар ким дигәндә өч биологик кабатлаудан алынды һәм Бонферрони пост-хок тесты белән берьяклы ANOVAга дучар ителде. 0,05 тән кимрәк p-кыйммәте статистик яктан әһәмиятле дип саналды. Мәгълүматлар уртача ± SD буларак күрсәтелә, һәм һәр рәсемдә экспериментлар саны күрсәтелгән. Барлык анализлар һәм графиклар Windows өчен GraphPad Prism 8 статистик программасы ярдәмендә башкарылды (GraphPad Software Inc., 8.4.3 версиясе, Сан-Диего, АКШ).
Башта без сыворотка IPA дәрәҗәләренең бавыр, бөтен тән һәм митохондриаль транскриптлар белән бәйләнешен тикшердек. Гомуми транскрипт профилендә сыворотка IPA дәрәҗәләре белән бәйле иң көчле ген MAPKAPK3 иде (FDR = 0,0077; митоген белән активлаштырылган протеин киназа белән активлаштырылган протеин киназа 3); митохондрия белән бәйле транскрипт профилендә иң көчле бәйләнешле ген AKT1 иде (FDR = 0,7621; AKT серин/треонин киназа 1) (Өстәмә файл 1 һәм Өстәмә файл 2).
Аннары без глобаль транскриптларны (n = 268; p < 0.01) һәм митохондрия белән бәйле транскриптларны (n = 119; p < 0.05) анализладык, нәтиҗәдә апоптозны иң мөһим канон юл дип билгеләдек (p = 0.0089). Кан сарысуындагы IPA дәрәҗәләре белән бәйле митохондрия транскриптлары өчен без апоптозга (FDR = 0.00001), митофагиягә (FDR = 0.00029) һәм TNF сигнал юлларына (FDR = 0.000006) игътибар иттек (1А рәсем, 2 нче таблица һәм 1А-В өстәмә рәсемнәр).
Кеше бавырында глобаль, митохондрия белән бәйле транскриптларның һәм ДНК метиллашуының кан сарысуындагы IPA дәрәҗәләре белән бәйле кабатлану анализы. А төсе сыворотка IPA дәрәҗәләре белән бәйле 3092 CpG урыннарына күчерелгән 268 глобаль транскриптны, 119 митохондрия белән бәйле транскриптны һәм ДНК метиллаштырылган транскриптны күрсәтә (глобаль транскриптлар һәм метиллаштырылган ДНК өчен p кыйммәтләре < 0,01, ә митохондрия транскриптлары өчен p кыйммәтләре < 0,05). Төп кабатлану транскриптлары уртада күрсәтелгән (AKT1 һәм YKT6). B Иң югары үзара бәйләнеш баллына (0,900) ия булган 13 генның башка геннар белән үзара бәйләнеш картасы StringDB онлайн коралы ярдәмендә кан сарысуындагы IPA дәрәҗәләре белән сизелерлек бәйләнештә булган 56 кабатлану геныннан (кара сызык өлкәсе) төзелгән. Яшел: Ген Онтологиясе (GO) күзәнәк компонентына күчерелгән геннар: митохондрия (GO:0005739). AKT1 - мәгълүматларга нигезләнеп (текст эзләү, экспериментлар, мәгълүмат базалары һәм бергәләп экспрессияләү нигезендә) башка аксымнар белән үзара бәйләнешләр буенча иң югары баллга (0,900) ия булган аксым. Челтәр төеннәре аксымнарны, ә кырыйлары аксымнар арасындагы бәйләнешләрне күрсәтә.
Эчәк микробиота метаболитлары ДНК метилләшүе аша эпигенетик составны көйли алганлыктан [32], без сыворотка IPA дәрәҗәләренең бавыр ДНК метилләшүе белән бәйле булу-булмавын тикшердек. Без сыворотка IPA дәрәҗәләре белән бәйле ике төп метилләшү урынының пролин-серинга бай 3 нче өлкә (C19orf55) һәм җылылык шокы аксымы гаиләсе B (кечкенә) әгъзасы 6 (HSPB6) янында булуын ачыкладык (Өстәмә файл 3). 4350 CpG (p < 0,01) ДНК метилләшүе сыворотка IPA дәрәҗәләре белән корреляцияләнгән һәм озын гомерлелекнең көйләү юллары белән баетылган (p = 0,006) (1А рәсем, 2 нче таблица һәм 1С өстәмә рәсем).
Кеше бавырында сыворотка IPA дәрәҗәләре, глобаль транскриптлар, митохондрия белән бәйле транскриптлар һәм ДНК метилизациясе арасындагы бәйләнешләрнең нигезендә яткан биологик механизмнарны аңлау өчен, без алдагы юл анализында ачыкланган геннарның кабатлану анализын үткәрдек (1А рәсем). 56 кабатланучы генның юлны баету анализы нәтиҗәләре (1А рәсемдәге кара сызык эчендә) апоптоз юлы (p = 0.00029) өч анализ өчен уртак булган ике генны күрсәтте: AKT1 һәм YKT6 (YKT6 v-SNARE гомологы), Венн диаграммасында күрсәтелгәнчә (Өстәмә 2 нче рәсем һәм 1А рәсем). Кызыклысы шунда ки, без AKT1 (cg19831386) һәм YKT6 (cg24161647) сыворотка IPA дәрәҗәләре белән уңай корреляциядә булуын ачыкладык (Өстәмә 3 нче файл). Ген продуктлары арасындагы потенциаль аксым үзара бәйләнешләрен ачыклау өчен, без 56 кабатланучы ген арасыннан иң югары уртак өлкә баллы (0.900) булган 13 генны кертем буларак сайладык һәм үзара бәйләнеш картасын төзедек. Ышаныч дәрәҗәсенә (маргиналь ышаныч) карап, иң югары баллга (0,900) ия булган AKT1 гены иң югарыда иде (1B рәсем).
Юл анализы нигезендә, без апоптозның төп юл булуын ачыкладык, шуңа күрә без IPA белән дәвалауның HSCларның апоптозына in vitro йогынты ясавын тикшердек. Элегрәк без IPAның төрле дозаларының (10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ) LX-2 күзәнәкләре өчен токсик түгеллеген күрсәттек [15]. Бу тикшеренү 10 мкМ һәм 100 мкМ IPA белән дәвалауның яшәүчән һәм некротик күзәнәкләр санын арттыруын күрсәтте. Ләкин, контроль төркем белән чагыштырганда, күзәнәкнең яшәүчәнлеге 1 мМ IPA концентрациясендә кимеде, ә күзәнәк некрозы тизлеге үзгәрешсез калды (2А, В рәсемнәре). Аннары, LX-2 күзәнәкләрендә апоптозны китереп чыгару өчен оптималь концентрацияне табу өчен, без 24 сәгать дәвамында 10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ IPA белән тикшердек (2А-Е рәсеме һәм өстәмә 3А-В рәсеме). Кызыклысы шунда ки, IPA 10 μM һәм 100 μM апоптоз тизлеген (%) киметкән, ләкин IPA 1 mM контроль белән чагыштырганда соңгы апоптозны һәм апоптоз тизлеген (%) арттырган һәм шуңа күрә алга таба экспериментлар өчен сайланган (2A–D рәсемнәре).
IPA LX-2 күзәнәкләренең апоптозын китереп чыгара. Апоптоз тизлеген һәм күзәнәк морфологиясен агым цитометриясе ярдәмендә санлаштыру өчен Annexin V һәм 7-AAD икеләтә буяу ысулы кулланылды. BA күзәнәкләре 24 сәгать дәвамында 10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ IPA белән яки F–H TGF-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ IPA белән сывороткасыз мохиттә 24 сәгать дәвамында инкубацияләнде. A: тере күзәнәкләр (Annexin V -/ 7AAD-); B: некротик күзәнәкләр (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: иртә (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: соң (Annexin V+/7AAD.+); E, H: апоптоз тизлегендәге иртә һәм соңгы апоптоз күзәнәкләренең гомуми проценты (%). Мәгълүматлар уртача ± SD буларак күрсәтелә, n = 3 бәйсез эксперимент. Статистик чагыштырулар берьяклы ANOVA һәм Бонферрони пост-хок тесты ярдәмендә башкарылды. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Элегрәк күрсәткәнчә, 5 нг/мл TGF-β1 классик маркер геннары экспрессиясен арттыру юлы белән HSC активациясен стимуллаштыра ала [15]. LX-2 күзәнәкләре 5 нг/мл TGF-β1 һәм 1 мМ IPA белән бергә эшкәртелде (2E–H рәсем). TGF-β1 белән дәвалау апоптоз тизлеген үзгәртмәде, ләкин IPA белән бергә дәвалау TGF-β1 белән дәвалауга караганда соңгы апоптозны һәм апоптоз тизлеген (%) арттырды (2E–H рәсем). Бу нәтиҗәләр 1 мМ IPAның TGF-β1 индукциясеннән бәйсез рәвештә LX-2 күзәнәкләрендә апоптозны стимуллаштыра алуын күрсәтә.
Без LX-2 күзәнәкләрендә митохондриаль сулыш алуга IPA йогынтысын тагын да өйрәндек. Нәтиҗәләр күрсәткәнчә, 1 мМ IPA кислород куллану тизлеге (OCR) параметрларын киметә: митохондриаль булмаган сулыш алу, базаль һәм максималь сулыш алу, протон агып чыгу һәм АТФ җитештерү, контроль төркем белән чагыштырганда (3А, В рәсем), ә биоэнергетик сәламәтлек индексы (BHI) үзгәрмәде.
IPA LX-2 күзәнәкләрендә митохондриаль сулышны киметә. Митохондриаль сулыш алу кәкресе (OCR) митохондриаль сулыш алу параметрлары (митохондриаль булмаган сулыш алу, базаль сулыш алу, максималь сулыш алу, протон агып чыгу, АТФ генерациясе, SRC һәм BHI) буларак күрсәтелә. А һәм В күзәнәкләре 24 сәгать дәвамында 10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ IPA белән инкубацияләнде. С һәм D күзәнәкләре сывороткасыз мохиттә 24 сәгать дәвамында TGF-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ IPA белән инкубацияләнде. Барлык үлчәүләр дә CyQuant комплекты ярдәмендә ДНК эчтәлегенә нормальләштерелде. BHI: биоэнергетик сәламәтлек индексы; SRC: сулыш алу резерв сыйдырышлыгы; OCR: кислород куллану тизлеге. Мәгълүматлар уртача ± стандарт тайпылыш (SD) буларак күрсәтелә, n = 5 бәйсез эксперимент. Статистик чагыштырулар бер яклы ANOVA һәм Bonferroni пост-хок тесты ярдәмендә башкарылды. *p < 0.05; **p < 0.01; һәм ***p < 0.001
IPAның TGF-β1 белән активлаштырылган LX-2 күзәнәкләренең биоэнергетик профиленә йогынтысын тулырак аңлау өчен, без OCR ярдәмендә митохондрия оксидлашу фосфорлашуын анализладык (3C, D рәсем). Нәтиҗәләр күрсәткәнчә, TGF-β1 белән дәвалау контроль төркем белән чагыштырганда максималь сулыш алуны, сулыш алу резерв сыйдырышлыгын (SRC) һәм BHIны киметергә мөмкин (3C, D рәсем). Моннан тыш, комбинацияләнгән дәвалау базаль сулыш алуны, протон агып чыгуны һәм АТФ җитештерүне киметте, ләкин SRC һәм BHI TGF-β1 белән дәваланганнарга караганда күпкә югарырак иде (3C, D рәсем).
Шулай ук ​​без Seahorse программасы тарафыннан тәкъдим ителгән "Күзәнәк энергиясе фенотип тестын" үткәрдек (Өстәмә 4A–D рәсем). 3B өстәмә рәсемдә күрсәтелгәнчә, TGF-β1 белән дәвалаудан соң OCR һәм ECAR метаболик потенциаллары кимегән, ләкин контроль төркем белән чагыштырганда, комбинацияләнгән һәм IPA белән дәвалау төркемнәрендә аерма күзәтелмәгән. Моннан тыш, контроль төркем белән чагыштырганда, комбинацияләнгән һәм IPA белән дәвалаудан соң OCRның базаль һәм стресс дәрәҗәләре кимегән (Өстәмә 4C рәсем). Кызыклысы шунда ки, охшаш күренеш комбинацияләнгән терапия белән дә күзәтелгән, анда TGF-β1 белән дәвалауга караганда ECARның базаль һәм стресс дәрәҗәләрендә үзгәрешләр күзәтелмәгән (Өстәмә 4C рәсем). HSCларда митохондриаль оксидлашу фосфорлашуының кимүе һәм комбинацияләнгән дәвалауның TGF-β1 белән дәвалаудан соң SCR һәм BHIны торгызу сәләте метаболик потенциалны үзгәртмәгән (OCR һәм ECAR). Бу нәтиҗәләр бергәләп караганда, IPA HSCларда биоэнергетиканы киметергә мөмкин икәнен күрсәтә, бу IPA HSC фенотипын инактивациягә күчерә торган түбәнрәк энергетик профиль китереп чыгарырга мөмкин дигәнне аңлата (Өстәмә 4D рәсем).
IPA-ның митохондрия динамикасына йогынтысы митохондрия морфологиясенең һәм челтәр тоташуларының өч үлчәмле санлаштыруы, шулай ук ​​MTR буявы ярдәмендә тикшерелде (4 нче рәсем һәм 5 нче өстәмә рәсем). 4 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, контроль төркем белән чагыштырганда, TGF-β1 белән дәвалау уртача өслек мәйданын, тармак санын, гомуми тармак озынлыгын һәм тармак тоташу санын киметкән (4А һәм В рәсемнәре) һәм митохондрияләрнең өлешен сфериктан уртача морфологиягә үзгәрткән (4C рәсем). Бары тик IPA белән дәвалау гына митохондрияләрнең уртача күләмен киметкән һәм митохондрияләрнең өлешен сфериктан уртача морфологиягә үзгәрткән (4А рәсеме). Киресенчә, митохондрия мембранасының потенциалына бәйле MTR белән бәяләнә торган сфериклык, уртача тармак озынлыгы һәм митохондрия активлыгы (4А һәм Е рәсемнәре) үзгәрешсез калган һәм бу параметрлар төркемнәр арасында аерылып тормаган. Бергәләп караганда, бу нәтиҗәләр TGF-β1 һәм IPA белән дәвалау тере LX-2 күзәнәкләрендә митохондрия формасын һәм зурлыгын, шулай ук ​​челтәр катлаулылыгын модуляцияли кебек тоела.
IPA LX-2 күзәнәкләрендә митохондриаль динамиканы һәм митохондриаль ДНК күплеген үзгәртә. A. TGF-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ IPA белән 24 сәгать дәвамында сывороткасыз мохиттә инкубацияләнгән тере LX-2 күзәнәкләренең репрезентатив конфокаль рәсемнәре, аларда Mitotracker™ Red CMXRos белән буялган митохондриаль челтәрләр һәм DAPI белән зәңгәр төскә буялган төшләр күрсәтелә. Барлык мәгълүматларда да төркем саен ким дигәндә 15 рәсем бар иде. Без һәр үрнәк төре өчен 10 Z-стек рәсеме алдык. Һәр Z күчәре эзлеклелеге 30 кисәктән тора иде, һәрберсе 9,86 мкм калынлыкта. Масштаб: 10 мкм. B. Рәсемгә адаптив бусага куллану юлы белән ачыкланган репрезентатив объектлар (митохондрияләр генә). Һәр төркемдәге барлык күзәнәкләр өчен митохондриаль морфологик челтәр тоташуларын санлы анализлау һәм чагыштыру үткәрелде. C. Митохондриаль форма нисбәтләренең ешлыгы. 0 гә якын кыйммәтләр сферик формаларны, ә 1 гә якын кыйммәтләр җепселле формаларны күрсәтә. D Митохондриаль ДНК (мтДНК) эчтәлеге "Материаллар һәм методлар"да тасвирланганча билгеләнде. E Mitotracker™ Red CMXRos анализы "Материаллар һәм методлар"да тасвирланганча агым цитометриясе (30,000 вакыйга) ярдәмендә башкарылды. Мәгълүматлар уртача ± SD буларак күрсәтелә, n = 3 бәйсез эксперимент. Статистик чагыштырулар берьяклы ANOVA һәм Bonferroni пост-хок тесты ярдәмендә башкарылды. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Аннары без LX-2 күзәнәкләрендәге мтДНК күләмен митохондрия саны күрсәткече буларак анализладык. Контроль төркем белән чагыштырганда, TGF-β1 белән дәваланган төркемдә мтДНК күләме арткан (4D рәсем). TGF-β1 белән дәваланган төркем белән чагыштырганда, комбинацияләнгән дәвалау төркемендә мтДНК күләме кимегән (4D рәсем), бу IPA мтДНК күләмен һәм, мөгаен, митохондрия санын, шулай ук ​​митохондрия сулышын киметергә мөмкин дигәнне аңлата (3C рәсем). Моннан тыш, IPA комбинацияләнгән дәвалауда мтДНК күләмен киметкән кебек тоелды, ләкин MTR белән бәйле митохондрия активлыгына тәэсир итмәде (4A–C рәсемнәр).
Без IPA белән LX-2 күзәнәкләрендә фиброз, апоптоз, яшәү һәм митохондриаль динамика белән бәйле геннарның мРНК дәрәҗәләре арасындагы бәйләнешне тикшердек (5A–D рәсем). Контроль төркем белән чагыштырганда, TGF-β1 белән дәваланган төркемдә I типтагы коллаген α2 чылбыры (COL1A2), α-шома мускул актины (αSMA), матрица металлопротеиназа 2 (MMP2), металлопротеиназа 1 тукыма ингибиторы (TIMP1) һәм динамин 1 сыман ген (DRP1) кебек геннарның экспрессиясе артты, бу фиброз һәм активлашу артуын күрсәтә. Моннан тыш, контроль төркем белән чагыштырганда, TGF-β1 белән дәвалау ядро ​​прегнан X рецепторының (PXR), каспаза 8нең (CASP8), MAPKAPK3, B-күзәнәк α ингибиторы, ядро ​​факторы κ генының яктылык пептидын көчәйтүче (NFκB1A) һәм ядро ​​факторы κB киназа субберәмлеге β ингибиторының (IKBKB) мРНК дәрәҗәләрен киметте (5A–D рәсем). TGF-β1 белән дәвалау белән чагыштырганда, TGF-β1 һәм IPA белән бергә дәвалау COL1A2 һәм MMP2 экспрессиясен киметкән, ләкин PXR, TIMP1, B-күзәнәкле лимфома-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β һәм IKBKB мРНК дәрәҗәсен арттырган. IPA белән дәвалау MMP2, Bcl-2 белән бәйле X аксымы (BAX), AKT1, оптик атрофия аксымы 1 (OPA1) һәм митохондриаль кушылу аксымы 2 (MFN2) экспрессиясен сизелерлек киметкән, ә CASP8, NFκB1A, NFκB1B һәм IKBKB экспрессиясе контроль төркем белән чагыштырганда арткан. Ләкин каспаза-3 (CASP3), апоптотик пептидаза активлаштыручы фактор 1 (APAF1), митохондриаль кушылу аксымы 1 (MFN1) һәм бүленү аксымы 1 (FIS1) экспрессиясендә аерма табылмаган. Бу нәтиҗәләр бергәләп IPA дәвалавы фиброз, апоптоз, яшәү һәм митохондриаль динамика белән бәйле геннар экспрессиясен модуляцияли дип фаразлый. Безнең мәгълүматлар IPA дәвалавы LX-2 күзәнәкләрендә фиброзны киметә дип фаразлый; шул ук вакытта, ул фенотипны инактивациягә күчереп, яшәүне стимуллаштыра.
IPA LX-2 күзәнәкләрендә фибробласт, апоптотик, яшәүчәнлек һәм митохондриаль динамикасы геннарының экспрессиясен модуляцияли. Гистограммалар LX-2 күзәнәкләре сывороткасыз мохиттә TGF-β1 һәм IPA белән 24 сәгать дәвамында индукцияләнгәннән соң, эндоген контрольгә (RPLP0 яки PPIA) карата мРНК экспрессиясен күрсәтә. А фибробластларны, B апоптотик күзәнәкләрне, C исән калган күзәнәкләрне, ә D митохондриаль динамикасы генының экспрессиясен күрсәтә. Мәгълүматлар уртача ± стандарт тайпылыш (SD) буларак күрсәтелгән, n = 3 бәйсез эксперимент. Статистик чагыштырулар берьяклы ANOVA һәм Bonferroni пост-хок тесты ярдәмендә башкарылды. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Аннары, күзәнәк зурлыгындагы үзгәрешләр (FSC-H) һәм цитоплазматик катлаулылык (SSC-H) агым цитометриясе ярдәмендә бәяләнде (6А, В рәсем), ә IPA белән дәвалаудан соң күзәнәк морфологиясендәге үзгәрешләр трансмиссия электрон микроскопиясе (TEM) һәм фаза контраст микроскопиясе ярдәмендә бәяләнде (Өстәмә 6А-В рәсем). Көтелгәнчә, TGF-β1 белән дәваланган төркемдәге күзәнәкләр контроль төркем белән чагыштырганда зурлыгы буенча арткан (6А, В рәсем), бу тупас эндоплазматик челтәрнең (ER*) һәм фаголизосомаларның (P) классик киңәюен күрсәтә, бу гемопоэтик күзәнәк (HSC) активлашуын күрсәтә (Өстәмә 6А рәсем). Ләкин, TGF-β1 белән дәваланган төркем белән чагыштырганда, TGF-β1 һәм IPA комбинацияләнгән дәвалау төркемендә күзәнәк зурлыгы, цитоплазматик катлаулылык (6А, В рәсем) һәм ER* эчтәлеге кимегән (Өстәмә 6А рәсем). Моннан тыш, IPA белән дәвалау контроль төркем белән чагыштырганда күзәнәк зурлыгын, цитоплазматик катлаулылыкны (6А, В рәсемнәре), P һәм ER* эчтәлеген киметкән (Өстәмә 6А рәсем). Моннан тыш, контроль төркем белән чагыштырганда, IPA белән дәвалаудан соң 24 сәгатьтән соң апоптотик күзәнәкләрнең эчтәлеге арткан (ак уклар, Өстәмә 6В рәсем). Бу нәтиҗәләр бергәләп 1 мМ IPA HSC апоптозын стимуллаштыра һәм TGF-β1 белән китереп чыгарылган күзәнәк морфологик параметрларындагы үзгәрешләрне кире кайтара ала, шуның белән күзәнәк зурлыгын һәм катлаулылыгын көйли ала, бу HSC инактивациясе белән бәйле булырга мөмкин.
IPA LX-2 күзәнәкләрендә күзәнәк зурлыгын һәм цитоплазматик катлаулылыкны үзгәртә. Агым цитометриясе анализының репрезентатив рәсемнәре. Анализда LX-2 күзәнәкләре өчен махсус капка стратегиясе кулланылды: күзәнәк популяциясен билгеләү өчен SSC-A/FSC-A, дублетларны билгеләү өчен FSC-H/FSC-A, һәм күзәнәк зурлыгы һәм катлаулылык анализы өчен SSC-H/FSC-H. Күзәнәкләр сывороткасыз мохиттә 24 сәгать дәвамында TGF-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ IPA белән инкубацияләнде. LX-2 күзәнәкләре күзәнәк зурлыгы һәм цитоплазматик катлаулылык анализы өчен аскы сул квадрантка (SSC-H-/FSC-H-), өске сул квадрантка (SSC-H+/FSC-H-), аскы уң квадрантка (SSC-H-/FSC-H+) һәм өске уң квадрантка (SSC-H+/FSC-H+) бүленде. B. Күзәнәк морфологиясе FSC-H (алга таралу, күзәнәк зурлыгы) һәм SSC-H (янга таралу, цитоплазматик катлаулылык) (30,000 вакыйга) кулланып агым цитометриясе ярдәмендә анализланды. Мәгълүматлар уртача ± SD буларак күрсәтелә, n = 3 бәйсез эксперимент. Статистик чагыштырулар берьяклы ANOVA һәм Bonferroni пост-хок тесты ярдәмендә башкарылды. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 һәм ****p < 0.0001
IPA кебек эчәк метаболитлары тикшеренүләрнең кайнар темасына әйләнде, бу эчәк микробиотасында яңа максатлар табылырга мөмкин дигән фикерне күрсәтә. Шуңа күрә, кешеләрдә бавыр фиброзы белән бәйләнгән метаболит IPA [15] хайваннар модельләрендә потенциаль антифибротик кушылма булуы күрсәтелү кызыклы [13, 14]. Монда без беренче тапкыр 2 нче типтагы диабет (T2D) булмаган симез кешеләрдә сыворотка IPA һәм глобаль бавыр транскриптомикасы һәм ДНК метилляциясе арасындагы бәйләнешне күрсәтәбез, апоптоз, митофагия һәм озын гомерлелекне, шулай ук ​​бавыр гомеостазын көйләүче AKT1 кандидат генын күрсәтәбез. Безнең тикшеренүнең тагын бер яңалыгы шунда ки, без IPA дәвалавының апоптоз, күзәнәк морфологиясе, митохондриаль биоэнергетика һәм LX-2 күзәнәкләрендә динамика белән үзара бәйләнешен күрсәттек, бу HSC фенотипын инактивациягә күчерә торган түбәнрәк энергия спектрын күрсәтә, IPA бавыр фиброзын яхшырту өчен потенциаль кандидат итә.
Без апоптоз, митофагия һәм озын гомерлелекнең кан әйләнешендәге IPA белән бәйле бавыр геннарында байытылган иң мөһим канон юллар булуын ачыкладык. Митохондрия сыйфатын контрольдә тоту (MQC) системасының бозылуы митохондрия дисфункциясенә, митофагиягә һәм апоптозга китерергә мөмкин, шуның белән MASLD барлыкка килүенә ярдәм итә [33, 34]. Шуңа күрә, IPA бавырда апоптоз, митофагия һәм озын гомерлелек аша күзәнәк динамикасын һәм митохондрия бөтенлеген саклауда катнаша ала дип фаразлый алабыз. Безнең мәгълүматлар өч анализда ике генның уртак булуын күрсәтте: YKT6 һәм AKT1. YKT6 - күзәнәк мембранасы кушылу процессында катнашучы SNARE аксымы икәнен билгеләп үтәргә кирәк. Ул аутофагосомада STX17 һәм SNAP29 белән башлангыч комплекс формалаштырып, аутофагия һәм митофагиядә роль уйный, шуның белән аутофагосомалар һәм лизосомаларның кушылуын стимуллаштыра [35]. Моннан тыш, YKT6 функциясенең югалуы митофагиянең бозылуына китерә [36], ә YKT6ның югарырак регуляциясе гепатоцеллюляр карцинома (HCC) үсеше белән бәйле, бу күзәнәкнең яшәүчәнлегенең артуын күрсәтә [37]. Икенче яктан, AKT1 - иң мөһим үзара бәйләнештә булган ген һәм бавыр авыруларында, шул исәптән PI3K/AKT сигнал юлында, күзәнәк циклында, күзәнәк миграциясендә, пролиферациясендә, фокаль адгезиядә, митохондриаль функциядә һәм коллаген секрециясендә мөһим роль уйный [38–40]. Активлаштырылган PI3K/AKT сигнал юлы гемопоэтик күзәнәкләрне (HSC) активлаштыра ала, алар күзәнәктән тыш матрица (ECM) җитештерү өчен җаваплы күзәнәкләр, һәм аның регуляциясенең бозылуы бавыр фиброзы барлыкка килүенә һәм үсешенә өлеш кертә ала [40]. Моннан тыш, AKT - p53-бәйле күзәнәк апоптозын тоткарлаучы күзәнәк яшәүчәнлегенең төп факторларының берсе, һәм AKT активациясе бавыр күзәнәкләренең апоптозын тоткарлау белән бәйле булырга мөмкин [41, 42]. Алынган нәтиҗәләр IPA гепатоцитларның апоптозга керү яки исән калу арасындагы карарына тәэсир итеп, бавыр митохондрияләре белән бәйле апоптозда катнашырга мөмкин дип күрсәтә. Бу йогынтылар бавыр гомеостазы өчен бик мөһим булган AKT һәм/яки YKT6 кандидат геннары белән көйләнергә мөмкин.
Безнең нәтиҗәләр күрсәткәнчә, 1 мМ IPA TGF-β1 белән дәвалаудан бәйсез рәвештә LX-2 күзәнәкләрендә апоптозны китереп чыгарган һәм митохондриаль сулыш алуны киметкән. Шунысы игътибарга лаек, апоптоз фиброзны бетерү һәм гемопоэтик күзәнәк (HSC) активлашуының төп юлы булып тора, һәм шулай ук ​​бавыр фиброзы белән бәйле кире кайтарыла торган физиологик җавапта төп вакыйга булып тора [4, 43]. Моннан тыш, LX-2 күзәнәкләрендә BHIның комбинацияләнгән дәвалаудан соң торгызылуы IPAның митохондриаль биоэнергетиканы көйләүдәге потенциаль роленә яңа карашлар бирде. Тынычлык һәм актив булмаган шартларда гемопоэтик күзәнәкләр гадәттә митохондриаль оксидлашу фосфорлашуын ATP җитештерү өчен кулланалар һәм метаболик активлыгы түбән. Икенче яктан, HSC активлашуы гликолитик халәткә керүнең энергия ихтыяҗларын компенсацияләү өчен митохондриаль сулыш алуны һәм биосинтезны көчәйтә [44]. IPA метаболик потенциалга һәм ECARга тәэсир итмәве гликолитик юлның өстенлекле булмавын күрсәтә. Шулай ук, башка бер тикшеренү күрсәткәнчә, 1 мМ IPA кардиомиоцитларда, кеше гепатоцит күзәнәк линиясендә (Huh7) һәм кеше кендек венасы эндотелиаль күзәнәкләрендә (HUVEC) митохондриаль сулыш чылбыры активлыгын модуляцияли алган; Ләкин IPA кардиомиоцитларда гликолизга бернинди йогынтысы да табылмаган, бу IPA башка күзәнәк төрләренең биоэнергетикасына тәэсир итә ала дигәнне аңлата [45]. Шуңа күрә без 1 мМ IPA йомшак химик аергыч булып эшли ала дип фаразлыйбыз, чөнки ул фиброген ген экспрессиясен, күзәнәк морфологиясен һәм митохондриаль биоэнергетиканы mtDNA күләмен үзгәртмичә сизелерлек киметә ала [46]. Митохондриаль аергычлар культура белән индукцияләнгән фиброзны һәм HSC активациясен тоткарлый ала [47] һәм аеручы аксымнар (UCP) яки аденин нуклеотид транслоказасы (ANT) кебек кайбер аксымнар белән көйләнә яки индукцияләнә торган митохондриаль АТФ җитештерүне киметә ала. Күзәнәк төренә карап, бу күренеш күзәнәкләрне апоптоздан саклый һәм/яки апоптозны стимуллаштыра ала [46]. Шулай да, IPA-ның гемопоэтик күзәнәкләрне инактивлаштыруда митохондриаль аергыч буларак ролен ачыклау өчен өстәмә тикшеренүләр кирәк.
Аннары без митохондриаль сулыш алудагы үзгәрешләрнең тере LX-2 күзәнәкләрендә митохондриаль морфологиядә чагылыш табуын тикшердек. Кызыклысы шунда ки, TGF-β1 белән дәвалау митохондриаль пропорцияне сфериктан уртача формага үзгәртә, митохондриаль тармаклану кимүе һәм митохондриаль бүленүдә төп фактор булган DRP1 экспрессиясенең артуы белән бәйле [48]. Моннан тыш, митохондриаль фрагментация гомуми челтәр катлаулылыгы белән бәйле, һәм кушылудан бүленүгә күчү гемопоэтик күзәнәк (HSC) активлашуы өчен бик мөһим, ә митохондриаль бүленүне ингибирлау HSC апоптозына китерә [49]. Шулай итеп, безнең нәтиҗәләр TGF-β1 белән дәвалау тармаклану кимүе белән митохондриаль челтәр катлаулылыгының кимүенә китерергә мөмкин икәнен күрсәтә, бу активлаштырылган гемопоэтик күзәнәкләр (HSC) белән бәйле митохондриаль бүленүдә ешрак очрый. Моннан тыш, безнең мәгълүматлар IPA митохондрия пропорциясен сфериктан уртача формага үзгәртә алуын, шуның белән OPA1 һәм MFN2 экспрессиясен киметә алуын күрсәтте. Тикшеренүләр OPA1-нең түбәнәюе митохондриаль мембрана потенциалының кимүенә китерергә һәм күзәнәк апоптозын башлап җибәрергә мөмкин икәнен күрсәтте [50]. MFN2 митохондрия кушылуын һәм апоптозны җайга салуы билгеле [51]. Алынган нәтиҗәләр LX-2 күзәнәкләрен TGF-β1 һәм/яки IPA белән индукцияләү митохондрия формасын һәм зурлыгын, шулай ук ​​активлашу халәтен һәм челтәр катлаулылыгын модуляцияли кебек.
Безнең нәтиҗәләр TGFβ-1 һәм IPA белән берлектә дәвалау апоптоздан качучы күзәнәкләрдә фиброз, апоптоз һәм яшәү белән бәйле геннарның мРНК экспрессиясен көйләү юлы белән мтДНК һәм күзәнәк морфологик параметрларын киметергә мөмкин икәнен күрсәтә. Чыннан да, IPA AKT1 һәм COL1A2 һәм MMP2 кебек мөһим фиброз геннарының мРНК экспрессиясе дәрәҗәсен киметте, ләкин апоптоз белән бәйле CASP8 экспрессиясе дәрәҗәсен арттырды. Безнең нәтиҗәләр IPA белән дәвалаудан соң BAX экспрессиясе кимегәнен һәм TIMP1 гаиләсе субберәмлекләренең, BCL-2 һәм NF-κB мРНК экспрессиясе артканын күрсәтте, бу IPA апоптоздан качучы гемопоэтик күзәнәкләрдә (HSC) яшәү сигналларын стимуллаштыра ала дигәнне аңлата. Бу молекулалар активлаштырылган гемопоэтик күзәнәкләрдә яшәү сигналлары булып хезмәт итә ала, бу антиапоптотик аксымнарның (мәсәлән, Bcl-2) экспрессиясенең артуы, проапоптотик BAX экспрессиясенең кимүе һәм TIMP һәм NF-κB арасындагы катлаулы үзара бәйләнеш белән бәйле булырга мөмкин [5, 7]. IPA үз йогынтысын PXR аша күрсәтә, һәм без TGF-β1 һәм IPA белән комбинацияләнгән дәвалау PXR мРНК экспрессиясе дәрәҗәсен арттырганын ачыкладык, бу HSC активациясенең басылуын күрсәтә. Активлаштырылган PXR сигнализациясе HSC активациясен in vivo һәм in vitro шартларында тоткарлый дип билгеле [52, 53]. Безнең нәтиҗәләр IPA апоптозны стимуллаштыру, фиброзны һәм митохондриаль метаболизмны киметү һәм яшәү сигналларын көчәйтү юлы белән активлаштырылган HSCларны чистартуда катнаша ала, бу активлаштырылган HSC фенотипын инактивлаштырылганга әйләндерә торган типик процесслар. Апоптоздагы IPA потенциаль механизмы һәм роле өчен тагын бер мөмкин аңлатма - ул дисфункциональ митохондрияләрне, нигездә, митофагия (эчке юл) һәм тышкы TNF сигнал юлы (1 нче таблица) аша чистарта, бу турыдан-туры NF-κB яшәү сигнал юлы белән бәйләнгән (Өстәмә 7 нче рәсем). Кызыклысы шунда ки, IPA белән бәйле байытылган геннар апоптоз юлында проапоптотик һәм про-яшәеш сигналларын китереп чыгара ала [54], бу IPA бу геннар белән үзара бәйләнештә апоптотик юлны яки яшәүне китереп чыгарырга мөмкин дип фаразлый. Ләкин, IPA HSC активлаштыру вакытында апоптозны яки яшәүне ничек китереп чыгаруы һәм аның механик юллары ачык түгел.
IPA - эчәк микробиотасы аша ашаган триптофаннан барлыкка килгән микроб метаболиты. Тикшеренүләр күрсәткәнчә, аның эчәк мохитендә ялкынсынуга каршы, антиоксидант һәм эпигенетик көйләү үзлекләренә ия.[55] Тикшеренүләр IPA эчәк барьеры функциясен модуляцияли һәм оксидлашу стрессын киметә ала, бу аның җирле физиологик йогынтысына өлеш кертә ала.[56] Чынлыкта, IPA кан әйләнеше аша максатлы органнарга күчерелә, һәм IPA триптофан, серотонин һәм индол туындылары белән охшаш төп метаболит структурасына ия булганлыктан, IPA метаболик йогынты ясый, нәтиҗәдә конкурент метаболик үзгәрешләргә китерә.[52] IPA ферментларда яки рецепторларда бәйләнеш урыннары өчен триптофаннан алынган метаболитлар белән конкурентлаша ала, бу нормаль метаболик юлларны бозарга мөмкин. Бу аның терапевтик тәрәзәсен яхшырак аңлау өчен аның фармакокинетикасы һәм фармакодинамикасы буенча алга таба тикшеренүләр үткәрү кирәклеген күрсәтә.[57] Моның гемопоэтик күзәнәкләрдә (HSC) да була алу-алмавы әлегә ачыкланмый.
Без тикшеренүебезнең кайбер чикләүләре булуын таныйбыз. IPA белән бәйле бәйләнешләрне аерым тикшерү өчен, без 2 нче типтагы шикәр диабеты (2 нче типтагы шикәр диабеты) белән авыручыларны чыгардык. Без моның безнең ачышларның 2 нче типтагы шикәр диабеты һәм алга киткән бавыр авыруы белән авыручыларга киң кулланылышын чикләвен таныйбыз. Кеше кан сарысуындагы IPA физиологик концентрациясе 1–10 мкМ булса да [11, 20], 1 мМ IPA концентрациясе иң югары токсик булмаган концентрация [15] һәм иң югары апоптоз тизлегенә нигезләнеп сайланды, некротик күзәнәкләр популяциясенең процентында аерма булмады. Бу тикшеренүдә IPAның супрафизиологик дәрәҗәләре кулланылса да, хәзерге вакытта IPAның нәтиҗәле дозасы турында бердәм фикер юк [52]. Нәтиҗәләребез әһәмиятле булса да, IPAның киңрәк метаболик язмышы тикшеренүләрнең актив өлкәсе булып кала. Моннан тыш, кан сарысуындагы IPA дәрәҗәләре һәм бавыр транскриптларының ДНК метилләшүе арасындагы бәйләнеш турындагы ачышларыбыз гемопоэтик күзәнәкләрдән (HSC) генә түгел, ә бавыр тукымаларыннан да алынды. Без кеше LX-2 күзәнәкләрен куллануны сайладык, транскриптом анализыннан алынган алдагы нәтиҗәләргә нигезләнеп, IPA гемопоэтик күзәнәк (HSC) активлашуы белән бәйле [15], һәм HSCлар бавыр фиброзы үсешендә катнашкан төп күзәнәкләр. Бавыр берничә күзәнәк төреннән тора, шуңа күрә IPA ролен һәм аның башка бавыр күзәнәк төрләре белән үзара бәйләнешен өйрәнү өчен каспаза активлашуы һәм ДНК фрагментациясе белән берләштерелгән гепатоцит-HSC-иммун күзәнәк ко-культура системасы, шулай ук ​​аксым дәрәҗәсен дә кертеп, эш итү механизмын карарга кирәк.