Төрле үсемлекләрне саклау теорияләре үсемлекләрнең махсуслаштырылган метаболизмы үрнәкләрен аңлату өчен мөһим теоретик күрсәтмәләр бирә, ләкин аларның төп фаразлары әле тикшерелергә тиеш. Монда без тәмәке белән зарарланган штаммнарның аерым үсемлекләрдән популяцияләргә һәм якын туган төрләргә кадәр метаболомын системалы рәвештә өйрәнү өчен объектив тандем масса-спектрометрия (MS/MS) анализын кулландык, һәм мәгълүматтагы кушылма спектрларга нигезләнгән күп санлы масса-спектрометрик үзенчәлек теорияләрен эшкәрттек. Оптималь саклау (OD) һәм хәрәкәтләнүче максат (MT) теорияләренең төп фаразларын тикшерү өчен рамка. Үсемлек метаболомикасының мәгълүмати компоненты OD теориясенә туры килә, ләкин MT теориясенең үлән ашаучылар китереп чыгарган метаболомика динамикасына төп фаразына каршы килә. Микродан макроэволюцион масштабка кадәр ясмонат сигналы ODның төп детерминанты буларак билгеләнде, ә этилен сигналы MS/MS молекуляр челтәре белән аңлатылган үлән ашаучыларга хас җавапны төгәл көйләүне тәэмин итте.
Төрле структуралы махсус метаболитлар үсемлекләрнең мохиткә яраклашуында, бигрәк тә дошманнардан саклануда төп катнашучылар булып тора (1). Үсемлекләрдә очрый торган махсус метаболизмның гаҗәеп төрлелеге аның экологик функцияләренең күп аспектлары буенча дистә еллар дәвамында тирәнтен тикшеренүләргә этәргеч бирде һәм үсемлекләрне саклау теорияләренең озын исемлеген формалаштырды, алар үсемлек-бөҗәк үзара бәйләнешләренең эволюцион һәм экологик үсеше. Эмпирик тикшеренүләр мөһим күрсәтмәләр бирә (2). Ләкин бу үсемлекләрне саклау теорияләре гипотетик дедуктив фикерләүнең норматив юлыннан бармады, анда төп фаразлар бер үк анализ дәрәҗәсендә иде (3) һәм теоретик үсешнең киләсе циклын алга этәрү өчен эксперименталь рәвештә сынап каралды (4). Техник чикләүләр мәгълүмат җыюны билгеле бер метаболик категорияләр белән чикли һәм махсуслаштырылган метаболитларның комплекслы анализын чикли, шулай итеп теоретик үсеш өчен мөһим булган категорияләрара чагыштыруларны булдырмый (5). Комплекслы метаболомика мәгълүматларының һәм төрле үсемлек төркемнәре арасында метаболик киңлекнең эшкәртү процессын чагыштыру өчен уртак валютаның булмавы бу өлкәнең фәнни өлгергәнлегенә комачаулый.
Тандем масса-спектрометриясе (MS/MS) метаболомикасы өлкәсендәге соңгы казанышлар билгеле бер система клады эчендәге һәм төрләр арасындагы метаболик үзгәрешләрне комплекслы характерлый ала, һәм бу катлаулы катнашмалар арасындагы структураль охшашлыкны исәпләү өчен исәпләү ысуллары белән берләштерелергә мөмкин. Химия буенча алдан белем (5). Анализ һәм исәпләү өлкәсендә алдынгы технологияләрнең берләшүе метаболик төрлелекнең экологик һәм эволюцион теорияләре тарафыннан ясалган күп фаразларны озак вакытлы тикшерү өчен кирәкле нигез бирә. Шеннон (6) 1948 елда үзенең төп мәкаләсендә беренче тапкыр мәгълүмат теориясен кертте, мәгълүматның математик анализына нигез салды, ул башлангыч кулланудан тыш күп кенә өлкәләрдә дә кулланылды. Геномикада мәгълүмат теориясе эзлеклелекнең консерватив мәгълүматын санлаштыру өчен уңышлы кулланылды (7). Транскриптомика тикшеренүләрендә мәгълүмат теориясе транскриптомдагы гомуми үзгәрешләрне анализлый (8). Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләрдә без үсемлекләрдәге тукыма дәрәҗәсенең метаболик экспертизасын тасвирлау өчен мәгълүмат теориясенең статистик нигезен метаболомикага кулландык (9). Монда без үсемлек ашаучылар тарафыннан китереп чыгарылган метаболомның үсемлекләрне яклау теориясенең төп фаразларын чагыштыру өчен, MS/MS нигезендәге эш процессын мәгълүмат теориясенең статистик кысасы белән берләштерәбез, ул гомуми валютадагы метаболик төрлелек белән характерлана.
Үсемлекләрне яклауның теоретик рамкалары гадәттә үзара бәйләнешле һәм ике категориягә бүленергә мөмкин: оптималь яклау (OD) (10), хәрәкәтләнүче максат (MT) (11)) һәм тышкы кыяфәт (12) теориясе кебек саклау функцияләренә нигезләнеп, үсемлеккә хас метаболитларның таралышын аңлатырга тырышучылар, ә башкалар ресурсларның булуы үзгәрүенең үсемлек үсешенә һәм махсуслаштырылган метаболитлар туплануына, мәсәлән, углерод: туклыклы матдәләр балансы гипотезасы (13), үсеш тизлеге гипотезасы (14) һәм үсеш һәм дифференциация тигезлеге гипотезасы (15) ничек тәэсир итүен механик аңлатмалар эзлиләр. Ике теория җыелмасы төрле анализ дәрәҗәләрендә (4). Ләкин, үсемлекләрнең конститутив һәм индуктив яклаулары турындагы сөйләшүдә функциональ дәрәҗәдәге саклау функцияләрен үз эченә алган ике теория өстенлек итә: OD теориясе, ул үсемлекләрнең кыйммәтле химик саклауларына кирәк булганда гына, мәсәлән, алар ашаганда гына инвестицияләр салуларын фаразлый. Шуңа күрә үлән хайваны һөҗүм иткәндә, киләчәктә һөҗүм итү мөмкинлегенә карап, саклау функциясе булган кушылма билгеләнә (10); MT гипотезасы юнәлешле метаболит үзгәрү күчәре юклыгын, ләкин метаболит очраклы рәвештә үзгәрүен фаразлый, шуның белән һөҗүм итүче үлән ашаучыларның метаболик "хәрәкәт максатына" комачаулау мөмкинлеге туа. Икенче төрле әйткәндә, бу ике теория үлән ашаучылар һөҗүменнән соң барлыкка килгән метаболик ремоделизация турында капма-каршы фаразлар ясый: метаболитларның бер юнәлешле туплануы һәм саклану функциясе (ОФ) һәм юнәлешсез метаболик үзгәрешләр (МТ) арасындагы бәйләнеш (11).
OD һәм MT гипотезалары метаболомдагы индукцияләнгән үзгәрешләрне генә түгел, ә бу метаболитлар туплануның экологик һәм эволюцион нәтиҗәләрен дә үз эченә ала, мәсәлән, бу метаболик үзгәрешләрнең билгеле бер экологик мохиттә адаптив чыгымнары һәм файдасы (16). Ике гипотеза да махсуслаштырылган метаболитларның саклану функциясен таный, алар кыйммәт булырга да, булмаска да мөмкин, ләкин OD һәм MT гипотезаларын аерып торучы төп фараз индукцияләнгән метаболик үзгәрешләрнең юнәлешендә ята. OD теориясен фаразлау әлегә кадәр иң күп эксперименталь игътибарны җәлеп итте. Бу сынауларга парникларда һәм табигый шартларда билгеле бер кушылмаларның төрле тукымаларының турыдан-туры яки туры булмаган саклану функцияләрен өйрәнү, шулай ук ​​үсемлекләрнең үсеш стадиясендәге үзгәрешләр керә (17-19). Ләкин, әлегә кадәр, теләсә нинди организмның метаболик төрлелеген глобаль комплекслы анализлау өчен эш процессы һәм статистик база булмау сәбәпле, ике теория арасындагы төп аерманы фаразлау (ягъни метаболик үзгәрешләр юнәлеше) тикшерелергә тиеш. Монда без шундый анализ тәкъдим итәбез.
Үсемлекләргә хас метаболитларның иң мөһим үзенчәлекләренең берсе - аларның аерым үсемлекләрдән алып охшаш төрләргә кадәр барлык дәрәҗәләрдә дә экстремаль структураль төрлелеге (20). Популяция масштабында махсуслаштырылган метаболитларда күп санлы үзгәрешләр күзәтелергә мөмкин, ә көчле сыйфат аермалары гадәттә төр дәрәҗәсендә саклана (20). Шуңа күрә үсемлекләрнең метаболик төрлелеге функциональ төрлелекнең төп аспекты булып тора, ул төрле нишаларга, бигрәк тә махсус бөҗәкләр һәм гадәти үлән ашаучыларның төрле инвазия мөмкинлекләре булган нишаларга җайлашучанлыкны чагылдыра (21). Френкельнең (22) үсемлеккә хас метаболитларның булу сәбәпләре турындагы новатор мәкаләсеннән бирле, төрле бөҗәкләр белән үзара бәйләнеш мөһим сайлау басымы дип санала, һәм бу үзара бәйләнешләр эволюция барышында үсемлекләрне формалаштырган дип санала. Метаболик юл (23). Махсуслаштырылган метаболитларның төрлелегендәге төрара аермалар шулай ук ​​үсемлекләрнең үлән ашаучылар стратегияләреннән саклануы белән бәйле физиологик балансны да чагылдырырга мөмкин, чөнки ике төр еш кына бер-берсе белән тискәре корреляциядә була (24). Һәрвакыт яхшы саклануны саклап калу файдалы булса да, саклану белән бәйле вакытында метаболик үзгәрешләр үсемлекләргә башка физиологик инвестицияләргә кыйммәтле ресурслар бүлеп бирү мөмкинлеген бирә (19, 24) һәм симбиозга мохтаҗлыктан котылу өчен ачык файда китерә. Коллатераль зыян (25). Моннан тыш, бөҗәкләрнең үлән ашаучы хайваннар аркасында махсуслаштырылган метаболитларның бу үзгәртеп корулары популяциядә җимергеч таралуга китерергә мөмкин (26), һәм популяциядә сакланып калырга мөмкин булган ясмон кислотасы (JA) сигналындагы җитди табигый үзгәрешләрнең турыдан-туры күрсәткечләрен чагылдырырга мөмкин. Югары һәм түбән JA сигналлары - үлән ашаучы хайваннардан саклану һәм билгеле бер төрләр белән көндәшлек арасындагы компромисс (27). Моннан тыш, махсуслаштырылган метаболит биосинтетик юллары эволюция барышында тиз югалачак һәм трансформациягә дучар булачак, бу якын туган төрләр арасында метаболик таралыштыруның өзеклегенә китерә (28). Бу полиморфизмнар үлән ашаучы хайваннар үрнәкләренең үзгәрүенә җавап итеп тиз урнаштырылырга мөмкин (29), бу үлән ашаучы хайваннар җәмгыятьләренең тирбәнешләре метаболик гетерогенлыкны этәрүче төп фактор булуын аңлата.
Монда без түбәндәге мәсьәләләрне аерым чиштек. (I) Үлән ашаучы бөҗәк үсемлек метаболомын ничек яңадан конфигурацияли? (Ii) Озак вакытлы саклану теориясенең фаразларын тикшерү өчен метаболик пластиклыкның төп мәгълүмат компонентлары нинди? (Iii) Үсемлек метаболомын һөҗүм итүчегә генә хас булган ысул белән яңадан программалаштырыргамы, әгәр шулай икән, үсемлек гормоны билгеле бер метаболик җавапны көйләүдә нинди роль уйный, һәм нинди метаболитлар саклануның төр спецификасына өлеш кертә? (IV) Күп кенә саклану теорияләре фаразларын биологик тукымаларның барлык дәрәҗәләренә дә таратырга мөмкин булганлыктан, без эчке чагыштырудан төрара чагыштыруга кадәр метаболик җавапның ни дәрәҗәдә туры килүен сорадык. Шушы максаттан без тәмәке никотинының яфрак метаболомын системалы рәвештә өйрәндек, ул бай махсуслаштырылган метаболизмлы экологик модель үсемлек һәм ике җирле үлән ашаучы хайванның - Lepidoptera Datura (Ms) личинкаларына каршы нәтиҗәле (бик агрессив, нигездә ашала). Solanaceae һәм Spodoptera littoralis (Sl) үсемлекләрендә мамык яфрагы кортлары бер төрле "ыру" булып тора, аларда Solanaceae хуҗа үсемлекләре һәм башка ырулар һәм гаиләләрнең хуҗалары бар. Үсемлек азыгы. Без MS/MS метаболомика спектрын анализладык һәм OD һәм MT теорияләрен чагыштыру өчен мәгълүмат теориясе статистик дескрипторларын чыгардык. Төп метаболитларның үзенчәлекләрен ачыклау өчен специфик карталар төзедек. Анализ N. nasi һәм аңа якын тәмәке төрләренең җирле популяциясенә дә киңәйтелде, үсемлек гормоннары сигнализациясе һәм OD индукциясе арасындагы ковариансны тагын да анализлау өчен.
Үлән ашаучы тәмәкенең яфрак метаболомының пластиклыгы һәм структурасы турында гомуми картаны төшерү өчен, без үсемлек экстрактларыннан югары сыйфатлы мәгълүматлардан бәйсез MS/MS спектрларын комплекслы җыю һәм деконволюцияләү өчен алдан эшләнгән анализ һәм исәпләү эш процессын кулландык (9). Бу дифференциацияләнмәгән ысул (MS/MS дип атала) артык булмаган кушылма спектрларын төзи ала, аларны аннары монда тасвирланган барлык кушылма дәрәҗәсендәге анализлар өчен кулланырга мөмкин. Бу деконволюцияләнгән үсемлек метаболитлары төрле төрләрдә була, алар йөзләгәннән меңләгән метаболитлардан тора (монда якынча 500-1000-с/MS/MS). Монда без мәгълүмат теориясе кысаларында метаболик пластиклыкны карыйбыз һәм метаболик ешлык бүленешенең Шеннон энтропиясенә нигезләнеп метаболомның төрлелеген һәм профессиональлеген санлаштырабыз. Элегрәк гамәлгә ашырылган формуланы (8) кулланып, без метаболом төрлелеген (Hj индикаторы), метаболик профиль махсуслашуын (δj индикаторы) һәм бер метаболитның метаболик спецификлыгын (Si индикаторы) санлаштыру өчен кулланылырга мөмкин булган күрсәткечләр җыелмасын исәпләдек. Моннан тыш, без үлән ашаучыларның метаболом индуктивлыгын санлаштыру өчен Чагыштырма ераклык пластиклыгы индексын (RDPI) кулландык (1А рәсем) (30). Бу статистик кысалар эчендә без MS/MS спектрын төп мәгълүмат берәмлеге итеп карыйбыз һәм MS/MS чагыштырмача күплеген ешлык бүленеше картасына эшкәртәбез, аннары аннан метаболом төрлелеген бәяләү өчен Шеннон энтропиясен кулланабыз. Метаболом махсуслашуы бер MS/MS спектрының уртача спецификасы белән үлчәнә. Шуңа күрә, үлән ашаучылар индукциясеннән соң кайбер MS/MS классларының күплегенең артуы спектр индуктивлыгына, RDPIга һәм махсуслашуга, ягъни δj индексының артуына әверелә, чөнки күбрәк махсуслашкан метаболитлар җитештерелә һәм югары Si индексы җитештерелә. Hj төрлелек индексының кимүе, я генерацияләнгән MS/MS саны кимүен, яки профиль ешлыгы бүленешенең тигез булмаган юнәлештә үзгәрүен, шул ук вакытта аның гомуми билгесезлеген киметүне күрсәтә. Si индексын исәпләү аша кайбер үлән ашаучылар тарафыннан нинди MS/MS индукцияләнгәнен, киресенчә, кайсы MS/MS индукциягә җавап бирмәвен ачыкларга мөмкин, бу MT һәм OD фаразлау өчен төп күрсәткеч булып тора.
(A) Үлән ашаучы (H1 - Hx) MS/MS мәгълүмат индуктивлыгы (RDPI), төрлелек (Hj индексы), махсуслашу (δj индексы) һәм метаболит спецификасы (Si индексы) өчен кулланыла торган статистик дескрипторлар. Махсуслашу дәрәҗәсенең артуы (δj) уртача алганда, күбрәк үлән ашаучыга хас метаболитлар җитештереләчәген күрсәтә, ә төрлелекнең кимүе (Hj) метаболитлар җитештерүнең кимүен яки таралу картасында метаболитларның тигез булмаган таралуын күрсәтә. Si кыйммәте метаболитның билгеле бер шартка хас булуын (монда үлән ашаучы) яки киресенчә, шул ук дәрәҗәдә саклануын бәяли. (B) Мәгълүмат теориясе күчәрен кулланып саклану теориясен фаразлауның концептуаль диаграммасы. OD теориясе үлән ашаучы хайваннар һөҗүменең саклану метаболитларын арттырачагын, шуның белән δj артуын фаразлый. Шул ук вакытта, Hj кими, чөнки профиль метаболик мәгълүматның кимү билгесезлегенә таба яңадан оештырыла. MT теориясе үлән ашаучы хайваннар һөҗүменең метаболомада юнәлешсез үзгәрешләргә китерәчәген, шуның белән Hj артуын метаболик мәгълүмат билгесезлегенең арту индикаторы буларак һәм Si очраклы таралуына китерәчәген фаразлый. Шулай ук ​​без катнаш модель, иң яхшы MT тәкъдим иттек, анда югарырак саклану кыйммәтләренә ия булган кайбер метаболитлар аеруча артачак (югары Si кыйммәте), ә кайберләре очраклы җаваплар күрсәтәчәк (түбәнрәк Si кыйммәте).
Мәгълүмат теориясе дескрипторларын кулланып, без OD теориясен фаразлау өчен аңлатабыз, индукцияләнмәгән конститутив халәттә үлән ашаучы хайваннар тарафыннан индукцияләнгән махсус метаболит үзгәрешләре (i) метаболик спецификаның артуына (Si индексы), метабономик спецификаның артуына (δj индексы) китерә. Югарырак саклану кыйммәтенә ия булган билгеле бер махсус метаболит төркемнәренең артуына һәм (ii) метаболик ешлык бүленешенең лептин гәүдәсенең күбрәк бүленешенә үзгәрүе аркасында метаболом төрлелегенең кимүенә (Hj индексы) китерәчәк. Бер метаболит дәрәҗәсендә тәртипләнгән Si бүленеше көтелә, анда метаболит үзенең саклану кыйммәтенә карап Si кыйммәтен арттырачак (1B рәсем). Бу юнәлештә без MT теориясен аңлатабыз, кузгатуның (i) метаболитларда юнәлешсез үзгәрешләргә китерәчәген фаразлау өчен, δj индексының кимүенә һәм (ii) метаболик билгесезлекнең артуы аркасында Hj индексының артуына китерәчәген фаразлау өчен. Яки очраклылык, аны Шеннон энтропиясе белән гомумиләштерелгән төрлелек рәвешендә санлаштырырга мөмкин. Метаболик составка килгәндә, MT теориясе Si очраклы бүленешен фаразлаячак. Кайбер метаболитларның билгеле бер шартларда билгеле бер шартларда булуын, ә башка шартларның билгеле бер шартларда булмавын һәм аларның саклану кыйммәтенең мохиткә бәйле булуын исәпкә алып, без шулай ук ​​катнаш саклану моделен тәкъдим иттек, анда δj һәм Hj Si буенча икегә бүленгән. Барлык юнәлешләрдә дә арту, саклану кыйммәтләре югарырак булган кайбер метаболит төркемнәре генә Si ны аеруча арттырачак, ә башкаларының очраклы таралышы булачак (1B рәсем).
Мәгълүмат теориясе дескрипторы күчәрендә яңадан билгеләнгән саклану теориясе фаразын тикшерү өчен, без Nepenthes pallens яфракларында эксперт (Ms) яки гомуми (Sl) үлән ашаучы личинкаларны үстердек (2А рәсем). MS/MS анализын кулланып, без кортлар белән тукланганнан соң җыелган яфрак тукымаларының метанол экстрактларыннан 599 артык булмаган MS/MS спектрларын (S1 мәгълүмат файлы) алдык. MS/MS конфигурация файлларында мәгълүмат эчтәлегенең яңадан конфигурациясен күз алдына китерү өчен RDPI, Hj һәм δj индексларын куллану кызыклы үрнәкләр ача (2B рәсем). Гомуми тенденция шунда ки, мәгълүмат дескрипторында тасвирланганча, кортлар яфраклар ашауны дәвам иткәндә, барлык метаболик үзгәртеп кору дәрәҗәсе вакыт узу белән арта: үлән ашаучы ашаганнан соң 72 сәгать узгач, RDPI сизелерлек арта. Зыян күрмәгән контроль белән чагыштырганда, Hj сизелерлек кимегән, бу метаболик профильнең махсуслашу дәрәҗәсе арту белән бәйле, ул δj индексы белән санлаштырылган. Бу күренгән тенденция OD теориясенең фаразларына туры килә, ләкин метаболит дәрәҗәсендәге очраклы (юнәлешсез) үзгәрешләр саклану камуфляжы буларак кулланыла дип саный торган MT теориясенең төп фаразларына туры килми (1B рәсем). Бу ике үлән ашаучы хайванның авыз куышлыгындагы секреция (OS) эликторы эчтәлеге һәм туклану тәртибе төрле булса да, аларның туры туклануы 24 сәгатьлек һәм 72 сәгатьлек уңыш җыю чорында Hj һәм δj юнәлешләрендә охшаш үзгәрешләргә китерде. Бердәнбер аерма RDPIның 72 сәгатендә булды. Ms туклану белән чагыштырганда, Sl туклану белән индукцияләнгән гомуми метаболизм югарырак булды.
(A) Эксперименталь дизайн: гади дуңгыз (S1) яки эксперт (Ms) үлән ашаучылар кувшин үсемлекләренең тозсызландырылган яфраклары белән туклана, ә симуляцияләнгән үлән ашаучылар өчен Ms OS (W + OSMs) стандартлаштырылган яфрак позицияләрен яралау өчен кулланыла. S1 (W + OSSl) личинкалары яки су (W + W). Контроль (C) - зыян күрмәгән яфрак. (B) Махсус метаболит картасы өчен исәпләнгән индуктивлык (RDPI контроль диаграммасы белән чагыштырганда), төрлелек (Hj индексы) һәм махсуслашу (δj индексы) индексы (599 MS/MS; мәгълүмат файлы S1). Йолдызчыклар турыдан-туры үлән ашаучылар белән туклану һәм контроль төркем арасындагы әһәмиятле аермаларны күрсәтә (парлы t-тест белән Студентның t-тест, *P<0.05 һәм ***P<0.001). ns, мөһим түгел. (C) Үлән ашаучы культураларны эшкәртүне симуляцияләгәннән соң төп (зәңгәр тартма, аминокислота, органик кислота һәм шикәр; S2 мәгълүмат файлы) һәм махсус метаболит спектрының (кызыл тартма 443 MS/MS; S1 мәгълүмат файлы) вакыт чишелеше индексы. Төс полосасы 95% ышаныч интервалын күрсәтә. Йолдызчык дәвалау һәм контроль арасындагы әһәмиятле аерманы күрсәтә [дисперсиянең квадрат анализы (ANOVA), аннан соң пост-хок күпсанлы чагыштырулар өчен Тукиның чыннан да әһәмиятле аермасы (HSD), *P<0.05, **P<0.01 Һәм *** P <0.001]. (D) Сибелгән графикларның һәм махсус метаболит профильләренең махсуслашуы (төрле эшкәртү белән кабатланган үрнәкләр).
Метаболом дәрәҗәсендә үлән ашаучылар тарафыннан барлыкка килгән ремоделизациянең аерым метаболитлар дәрәҗәсендәге үзгәрешләрдә чагылыш табуын тикшерү өчен, без башта Nepenthes pallens яфракларында элек өйрәнелгән һәм үлән ашаучыларга каршы торучанлыгы расланган метаболитларга игътибар иттек. Фенол амидлары - бөҗәкләрнең үлән ашау процессында тупланучы һәм бөҗәкләрнең эшчәнлеген киметүе билгеле булган гидроксициннамамид-полиамин конъюгатлары (32). Без тиешле MS/MS прекурсорларын эзләдек һәм аларның кумулятив кинетик сызыкларын төзедек (S1 рәсем). Гаҗәп түгел, үлән ашаучыларга каршы саклануда турыдан-туры катнашмаган фенол туындылары, мәсәлән, хлороген кислотасы (CGA) һәм рутин, үлән ашаганнан соң кими. Киресенчә, үлән ашаучылар фенол амидларын бик көчле итә ала. Ике үлән ашаучының өзлексез туклануы феноламидларның диярлек бер үк кузгату спектрына китерде, һәм бу үрнәк феноламидларның de novo синтезы өчен аеруча ачык иде. Шул ук күренеш 17-гидроксигеранилнонандиол дитерпен гликозидлары (17-HGL-DTGs) юлын өйрәнгәндә дә күзәтеләчәк, ул күп санлы ациклик дитерпеннарны нәтиҗәле анти-үлән ашау функцияләре белән җитештерә (33), шуларның Ms тукландыруы Sl белән охшаш экспрессия профилен башлап җибәрде (S1 рәсем)).
Турыдан-туры үлән ашаучы хайваннарны ашату экспериментларының мөмкин булган кимчелеге - үлән ашаучы хайваннарның яфрак куллану тизлеге һәм ашату вакытындагы аерма, бу яралар һәм үлән ашаучы хайваннар аркасында килеп чыккан үлән ашаучы хайваннарга хас эффектларны бетерүне катлауландыра. Яфрак метаболик реакциясенең үлән ашаучы хайваннар төренә хаслыгын яхшырак хәл итү өчен, без яңа җыелган OS (OSM һәм OSS1) яфрак позицияләренең W стандарт тишелешенә шунда ук кулланып, Ms һәм Sl личинкаларын ашатуны симуляцияләдек. Бу процедура W + OS эшкәртү дип атала, һәм ул тукыма югалту тизлегендә яки күләмендә аермаларның буталчык эффектларын тудырмыйча, үлән ашаучы хайваннар тарафыннан китереп чыгарылган реакциянең башлануын төгәл вакыт белән билгеләү юлы белән индукцияне стандартлаштыра (2А рәсем) (34). MS/MS анализы һәм исәпләү конвейерын кулланып, без турыдан-туры ашату экспериментларыннан элек җыелган спектрлар белән капланган 443 MS/MS спектрын (S1 мәгълүмат файлы) алдык. Бу MS/MS мәгълүматлар җыелмасының мәгълүмат теориясе анализы күрсәткәнчә, үлән ашаучыларны симуляцияләү юлы белән яфракларга махсуслашкан метаболомнарны яңадан программалаштыру OS-га хас индукцияләр күрсәткән (2C рәсем). Аерым алганда, OSS1 белән дәвалау белән чагыштырганда, OSM 4 сәгать эчендә метаболом махсуслашуының көчәюенә китергән. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, турыдан-туры үлән ашаучыларны тукландыру эксперименталь мәгълүматлар җыелмасы белән чагыштырганда, Hj һәм δj координаталары буларак ике үлчәмле киңлектә метаболик кинетика һәм вакыт узу белән симуляцияләнгән үлән ашаучыларны дәвалауга җавап итеп метаболом махсуслашуының юнәлеше күрсәтелгән. Арту эзлекле (2D рәсем). Шул ук вакытта, без метаболом экспертизасының бу максатчан артуы симуляцияләнгән үлән ашаучыларга җавап итеп үзәк углерод метаболизмын яңадан конфигурацияләү белән бәйлеме-юкмы икәнен тикшерү өчен аминокислоталар, органик кислоталар һәм шикәрләр эчтәлеген санлаштырдык (S2 мәгълүмат файлы). Бу үрнәкне яхшырак аңлату өчен, без элек каралган феноламид һәм 17-HGL-DTG юлларының метаболик туплану кинетикасын күзәттек. Үлән ашаучы хайваннарның OS-специфик индукциясе феноламид метаболизмы эчендә дифференциаль үзгәртеп кору үрнәгенә әверелә (S3 нче рәсем). Кумарин һәм кофеил өлешләрен үз эченә алган фенол амидлары OSS1 белән өстенлекле рәвештә индукцияләнә, ә OSMлар ферулил конъюгатларының специфик индукциясен башлап җибәрә. 17-HGL-DTG юлы өчен, түбән агым малониллашу һәм дималониллашу продуктлары белән дифференциаль OS индукциясе ачыкланган (S3 нче рәсем).
Аннары, без OS тарафыннан индукцияләнгән транскриптом пластиклыгын вакыт курсы микрочип мәгълүматлар җыелмасын кулланып өйрәндек, ул үлән ашаучы хайваннарда розетка үсемлеге яфракларын эшкәртү өчен OSM куллануны симуляцияли. Сайлап алу кинетикасы, нигездә, бу метаболомика тикшеренүендә кулланылган кинетика белән каплана (35). Метаболом пластиклыгы вакыт узу белән аеруча арткан метаболом реконфигурациясе белән чагыштырганда, без яфракларда Ms тарафыннан индукцияләнгән вакытлы транскрипция шартлауларын күзәтәбез, анда транскриптом индуктивлыгы (RDPI) һәм махсуслашу (δj) 1дә. Бу вакыт ноктасында сәгатьләр һәм төрлелек (Hj) сизелерлек артты, BMP1 экспрессиясе сизелерлек кимеде, аннары транскриптом махсуслашуы йомшарды (S4 рәсем). Метаболик ген гаиләләре (мәсәлән, P450, гликозилтрансфераза һәм BAHD ацилтрансфераза) югарыда телгә алынган иртә югары махсуслашу моделенә ияреп, беренчел метаболизмнан алынган структураль берәмлекләрдән махсус метаболитлар җыю процессында катнашалар. Очракны өйрәнү буларак, фенилаланин юлы анализланды. Анализ феноламид метаболизмындагы төп геннарның, җәлеп ителмәгән үсемлекләр белән чагыштырганда, үлән ашаучыларда OS белән югары дәрәҗәдә индукцияләнүен һәм аларның экспрессия үрнәкләре буенча тыгыз бәйләнештә булуын раслады. Бу юлның өске агымындагы MYB8 транскрипция факторы һәм PAL1, PAL2, C4H һәм 4CL структураль геннары транскрипциянең иртә башлануын күрсәтте. Феноламидның соңгы җыелмасында роль уйнаучы ацилтрансферазалар, мәсәлән, AT1, DH29 һәм CV86, озакка сузылган күтәрелү үрнәген күрсәтә (S4 рәсем). Югарыдагы күзәтүләр транскриптом махсуслашуының иртә башлануы һәм метаболомика махсуслашуының соңрак көчәюе берләштерелгән режим булуын күрсәтә, бу көчле саклану реакциясен башлап җибәрүче синхрон көйләү системасы белән бәйле булырга мөмкин.
Үсемлек гормоннары сигнализациясендәге реконфигурация үсемлекләр физиологиясен яңадан программалаштыру өчен үлән ашаучы мәгълүматны берләштерүче көйләүче катлам булып тора. Үлән ашаучы хайваннар симуляциясеннән соң, без төп үсемлек гормоннары категорияләренең кумулятив динамикасын үлчәдек һәм алар арасындагы вакытлыча бергә экспрессияне күз алдына китердек [Пирсон корреляция коэффициенты (PCC)> 0.4] (3А рәсем). Көтелгәнчә, биосинтез белән бәйле үсемлек гормоннары үсемлек гормоннарының бергә экспрессия челтәрендә бәйләнгән. Моннан тыш, төрле дәвалау белән индукцияләнгән үсемлек гормоннарын билгеләү өчен метаболик спецификлык (Si индексы) бу челтәргә күчерелә. Үлән ашаучы хайваннарга специфик җавапның ике төп өлкәсе күрсәтелә: берсе JA кластерында, анда JA (аның биологик яктан актив формасы JA-Ile) һәм башка JA туындылары иң югары Si баллын күрсәтә; икенчесе - этилен (ET). Гиббереллин үлән ашаучы хайваннарга спецификаның уртача гына артуын күрсәтте, ә цитокинин, ауксин һәм абсциз кислотасы кебек башка үсемлек гормоннары үлән ашаучылар өчен түбән индукцион спецификага ия булды. W + W куллану белән чагыштырганда, OS кушымтасы аша JA деривативларының пик кыйммәтенең көчәюе (W + OS), нигездә, JAларның көчле специфик күрсәткеченә әйләнергә мөмкин. Көтелмәгәнчә, төрле эликтор эчтәлеге булган OSM һәм OSS1 JA һәм JA-Ile охшаш туплануына китерә дип билгеле. OSS1дан аермалы буларак, OSM OSMлар тарафыннан махсус һәм көчле рәвештә стимуллаша, ә OSS1 базаль яраларның җавабын көчәйтми (3B рәсем).
(A) Үлән ашаучы хайваннар тарафыннан индукцияләнгән үсемлек гормоннары туплану кинетикасын симуляцияләүнең PCC исәпләвенә нигезләнгән бергә экспрессия челтәре анализы. Төен бер үсемлек гормонын күрсәтә, ә төеннең зурлыгы дәвалаулар арасында үсемлек гормонына хас Si индексын күрсәтә. (B) Төрле төсләр белән күрсәтелгән төрле дәвалаулар нәтиҗәсендә яфракларда JA, JA-Ile һәм ET туплануы: абрикос, W + OSM; зәңгәр, W + OSSl; кара, W + W; соры, C (контроль). Йолдызчыклар дәвалау һәм контроль арасындагы мөһим аермаларны күрсәтә (ике яклы ANOVA, аннан соң Tukey HSD пост-хок күпсанлы чагыштыру, *** P <0.001). ET сигналы бозылган ETR1'дә JA биосинтезында һәм бозылган кабул итү спектрында (irAOC һәм irCOI1) (C)697 MS/MS (мәгълүмат файлы S1) һәм (D)585 MS/MS (мәгълүмат файлы S1) мәгълүмат теориясе анализы. Ике симуляцияләнгән үлән ашаучы хайваннар белән дәвалау үсемлек линияләрен һәм буш транспорт чарасы (EV) контроль үсемлекләрен эшләтеп җибәрде. Йолдызчыклар W+OS белән дәвалау һәм зыян күрмәгән контроль арасындагы әһәмиятле аермаларны күрсәтә (ике яклы ANOVA, аннан соң Tukey HSD пост-хок күпсанлы чагыштыру, *P<0.05, **P<0.01 һәм ***P<0.001). (E) Махсуслашуга таралган каршылыкның таралган графиклары. Төсләр төрле генетик модификацияләнгән штаммнарны күрсәтә; символлар төрле дәвалау ысулларын күрсәтә: өчпочмак, W + OSS1; турыпочмаклык, W + OSM; түгәрәк C
Аннары, без JA һәм ET биосинтезының (irAOC һәм irACO) һәм кабул итүнең (irCOI1 һәм sETR1) төп этапларында үсемлек ашаучыларда бу ике үсемлек гормонының метаболизмын анализлау өчен генетик яктан модификацияләнгән көчсезләндерелгән Непентес штаммын (irCOI1 һәм sETR1) кулланабыз. Репрограммалаштыруның чагыштырмача өлеше. Элегерәк үткәрелгән экспериментлар белән туры китереп, без буш йөртүче (EV) үсемлекләрдә үлән ашаучы-OS индукциясен (3 нче рәсем, C дан D га кадәр) һәм OSM аркасында Hj индексының гомуми кимүен расладык, ә δj индексы арткан. Җавап OSS1 тарафыннан башланган җавапка караганда күбрәк күренә. Hj һәм δj координаталарын кулланган ике сызыклы график махсус дерегуляцияне күрсәтә (3E рәсем). Иң ачык тенденция - JA сигналы булмаган штаммнарда үлән ашаучылар аркасында метаболом төрлелеге һәм махсуслашу үзгәрешләре диярлек тулысынча юкка чыга (3C рәсем). Киресенчә, sETR1 үсемлекләрендә тын ET кабул итү, үлән ашаучы метаболизм үзгәрешләренә гомуми йогынты JA сигнализациясенә караганда күпкә түбәнрәк булса да, OSM һәм OSS1 кузгатулары арасындагы Hj һәм δj индексларындагы аерманы киметә (3D рәсем һәм S5 рәсем). Бу JA сигнал трансдукциясенең төп функциясеннән тыш, ET сигнал трансдукциясе үлән ашаучы хайваннарның төрләргә хас метаболик җавапны көйләү хезмәтен дә башкара дигәнне аңлата. Бу көйләү функциясенә туры китереп, sETR1 үсемлекләрендә гомуми метаболом индуктивлыгында үзгәрешләр булмады. Икенче яктан, sETR1 үсемлекләре белән чагыштырганда, irACO үсемлекләре үлән ашаучы хайваннар китереп чыгарган метаболик үзгәрешләрнең охшаш гомуми амплитудаларын китереп чыгардылар, ләкин OSM һәм OSS1 проблемалары арасында Hj һәм δj баллары шактый аерылып торды (S5 рәсем).
Үлән ашаучыларның төрләргә хас реакциясенә мөһим өлеш кертүче махсуслаштырылган метаболитларны ачыклау һәм аларның җитештерүен ET сигналлары аша көйләү өчен, без элек эшләнгән структураль MS/MS ысулын кулландык. Бу ысул метаболик гаиләне MS/MS фрагментларыннан [нормалаштырылган нокта продукты (NDP)] һәм нейтраль югалтуга (NL) нигезләнгән охшашлык баллыннан яңадан чыгару өчен би-кластерлаштыру ысулына таяна. ET трансген линияләрен анализлау аша төзелгән MS/MS мәгълүматлар җыелмасы 585 MS/MS (мәгълүмат файлы S1) бирде, алар аларны җиде төп MS/MS модуленә (M) кластерлаштыру юлы белән хәл ителде (4А рәсем). Бу модульләрнең кайберләре элек характерланган махсус метаболитлар белән тыгыз тупланган: мәсәлән, M1, M2, M3, M4 һәм M7 төрле фенол туындыларына (M1), флавоноид гликозидларына (M2), ацил шикәрләренә (M3 һәм M4) һәм 17-HGL-DTG (M7) бай. Моннан тыш, һәр модульдәге бер метаболитның метаболик специфик мәгълүматы (Si индексы) исәпләнә, һәм аның Si таралышын интуитив рәвештә күрергә мөмкин. Кыскасы, югары үлән ашау һәм генотип спецификасы күрсәтүче MS/MS спектрлары югары Si кыйммәтләре белән характерлана, һәм куртоз статистикасы уң койрык почмагындагы йон таралышын күрсәтә. Мондый ябык коллоид таралышы M1да ачыкланды, анда фенол амид иң югары Si фракциясен күрсәтте (4B рәсем). M7дагы алда телгә алынган үлән ашау индуктив 17-HGL-DTG уртача Si баллын күрсәтте, бу ике OS төре арасында уртача дәрәҗәдә дифференциаль көйләүне күрсәтә. Киресенчә, рутин, CGA һәм ацил шикәрләре кебек конститутив рәвештә җитештерелгән махсуслаштырылган метаболитларның күбесе иң түбән Si балллары арасында. Махсус метаболитлар арасындагы структураль катлаулылыкны һәм Si таралышын яхшырак өйрәнү өчен, һәр модуль өчен молекуляр челтәр төзелде (4B рәсем). OD теориясенең мөһим фаразы (1B рәсемдә кыскача күрсәтелгән) - үлән ашаганнан соң махсус метаболитларның яңадан оештырылуы югары саклану кыйммәтенә ия метаболитларда берьяклы үзгәрешләргә китерергә тиеш, бигрәк тә аларның спецификлыгын арттыру юлы белән (очраклы таралудан аермалы буларак). MT теориясе фаразлаган саклану метаболиты. M1да тупланган фенол туындыларының күбесе бөҗәкләрнең эшчәнлегенең кимүе белән функциональ яктан бәйле (32). 24 сәгать эчендә индукцияләнгән яфраклар һәм EV контроль үсемлекләренең состав яфраклары арасында M1 метаболитларындагы Si кыйммәтләрен чагыштырганда, без үлән ашаган бөҗәкләрдән соң күп метаболитларның метаболик спецификлыгы сизелерлек арту тенденциясенә ия булуын күзәттек (4C рәсем). Si кыйммәтенең чагыштырмача артуы саклану феноламидларында гына ачыкланды, ләкин бу модульдә бергә яшәүче башка фенолларда һәм билгесез метаболитларда Si кыйммәтенең артуы ачыкланмады. Бу OD теориясе белән бәйле махсуслаштырылган модель. Үлән ашаучылар китергән метаболик үзгәрешләрнең төп фаразлары туры килә. Феноламид спектрының бу үзенчәлеге OS-специфик ET белән индукцияләнгәнме-юкмы икәнен тикшерү өчен, без метаболит Si индексын төзедек һәм EV һәм sETR1 генотипларында OSM һәм OSS1 арасында дифференциаль экспрессия кыйммәтен билгеләдек (4D рәсем). sETR1дә фенамид индукциясе OSM һәм OSS1 арасындагы аерма шактый кимеде. Бикластерлаштыру ысулы шулай ук ​​JA белән көйләнгән метаболик махсуслашуга кагылышлы төп MS/MS модульләрен чыгару өчен JA җитмәгән штаммнарда җыелган MS/MS мәгълүматларына да кулланылды (S6 рәсем).
(A) Уртак фрагмент (NDP охшашлыгы) һәм уртак нейтраль югалту (NL охшашлыгы) нигезендә 585 MS/MS кластерлаштыру нәтиҗәләре (M) модуленең билгеле кушылма гаиләсе белән туры килүен яки билгесез яки начар метаболизмга дучар ителгән Метаболит составы белән бәйле булуын күрсәтә. Һәр модуль янында метаболитның (MS/MS) специфик (Si) бүленеше күрсәтелгән. (B) Модульле молекуляр челтәр: Төеннәр MS/MS һәм кырыйларын күрсәтә, NDP (кызыл) һәм NL (зәңгәр) MS/MS баллары (чикләү, > 0.6). Дәрәҗәләнгән метаболит спецификлыгы индексы (Si) модульгә нигезләнеп төсләнгән (сулда) һәм молекуляр челтәргә күчерелгән (уңда). (C) 24 сәгать эчендә конститутив (контроль) һәм индукцияләнгән хәлдәге (симуляцияләнгән үлән ашаучы) EV үсемлегенең M1 модуле: молекуляр челтәр диаграммасы (Si кыйммәте - төен зурлыгы, саклану феноламиды зәңгәр төс белән билгеләнгән). (D) EV һәм ET кабул итүе бозылган sETR1 спектр сызыгының M1 молекуляр челтәр диаграммасы: яшел түгәрәк төен белән күрсәтелгән фенол кушылмасы һәм W + OSM һәм W + OSS1 эшкәртүләре арасындагы әһәмиятле аерма (P кыйммәте) төен зурлыгы буларак. CP, N-кофеоил-тирозин; CS, N-кофеоил-спермидин; FP, N-ферул кислотасы эфир-сидек кислотасы; FS, N-ферулил-спермидин; CoP, N', N “-Кумаролил-тирозин; DCS, N', N”-дикаффеоил-спермидин; CFS, N', N”-кофеоил, ферулоил-спермидин; Wolfberry Son'дагы Lycium barbarum; Ник. O-AS, O-ацил шикәре.
Без анализны бер генә көчсезләнгән Непентес генотибыннан табигый популяцияләргә кадәр киңәйттек, анда үлән ашаучы JA дәрәҗәләрендә һәм махсус метаболит дәрәҗәләрендә көчле эчке үзгәрешләр элек табигый популяцияләрдә тасвирланган иде (26). Бу мәгълүматлар җыелмасын 43 гермоплазманы яктырту өчен кулланыгыз. Бу гермоплазмалар N. pallens үсемлекләренең 123 төреннән тора. Бу үсемлекләр Юта, Невада, Аризона һәм Калифорниядәге төрле җирле яшәү урыннарында җыелган орлыклардан алынган (S7 нче рәсем), без метаболом төрлелеген (монда популяция дәрәҗәсе дип атала) β төрлелеген) һәм OSM китереп чыгарган махсуслашуны исәпләдек. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләргә туры китереп, без Hj һәм δj күчәрләре буенча төрле метаболик үзгәрешләрне күзәттек, бу гермоплазмаларның үлән ашаучыларга метаболик җавапларының пластиклыгында сизелерлек аермалар булуын күрсәтә (S7 нче рәсем). Бу оешма үлән ашаучылар китереп чыгарган JA үзгәрешләренең динамик диапазоны турындагы элеккеге күзәтүләрне хәтерләтә һәм бер популяциядә бик югары кыйммәтне саклап калган (26, 36). Hj һәм δj арасындагы гомуми дәрәҗә корреляциясен тикшерү өчен JA һәм JA-Ile кулланып, без JA һәм метаболом β төрлелеге һәм махсуслашу индексы арасында сизелерлек уңай корреляция барлыгын ачыкладык (S7 нче рәсем). Бу популяция дәрәҗәсендә ачыкланган JA индукциясендә үлән ашаучы хайваннар тарафыннан китереп чыгарылган гетерогенлык бөҗәк үлән ашаучы хайваннардан сайлап алу нәтиҗәсендә килеп чыккан төп метаболик полиморфизмнар белән бәйле булырга мөмкин дигән фикерне аңлата.
Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр тәмәке төрләренең төре һәм индукцияләнгән һәм конститутив метаболик саклануга бәйлелеге буенча бик нык аерылып торуын күрсәтте. Үлән ашаучы хайваннарга каршы сигнал трансдукциясендәге һәм саклану мөмкинлекләрендәге бу үзгәрешләр бөҗәк популяциясе басымы, үсемлекләрнең яшәү циклы һәм билгеле бер төр үсә торган нишадагы саклану җитештерү чыгымнары белән көйләнә дип санала. Без Төньяк Америка һәм Көньяк Америкада туган алты Nicotiana төренең үлән ашаучылары тарафыннан индукцияләнгән яфрак метаболомы үзгәртеп коруның тотрыклылыгын өйрәндек. Бу төрләр Төньяк Америкадагы Nepenthes белән тыгыз туган, атап әйткәндә, Nicotiana Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. зәгыйфьләнгән үлән, Nicotiana tabacum, сызыклы тәмәке, тәмәке (Nicotiana spegazzinii) һәм тәмәке яфрагы тәмәкесе (Nicotiana obtusifolia) (5А рәсем) (37). Бу төрләрнең алтысы, шул исәптән яхшы характерланган N. please төрләре, petunia clade берьеллык үсемлекләре, ә obtusifolia N. Trigonophyllae апа кладының күпьеллык үсемлекләре (38). Аннары, бөҗәкләрнең туклануының төр дәрәҗәсендәге метаболик үзгәрешләрен өйрәнү өчен, бу җиде төрдә W + W, W + OSM һәм W + OSS1 индукциясе үткәрелде.
(A) Максималь ихтималлыкка [төш глутамин синтезы өчен (38)] һәм җиде тыгыз бәйле Nicotiana төренең (төрле төсләр) географик таралышына нигезләнгән башлангыч филогенетик агач (37). (B) Җиде Nicotiana төренең метаболик профильләре өчен махсуслаштырылган төрлелекнең таралу графигы (939 MS/MS; S1 мәгълүмат файлы). Төр дәрәҗәсендә метаболом төрлелеге махсуслашу дәрәҗәсе белән тискәре корреляцияләнә. Метаболик төрлелек һәм махсуслашу һәм JA туплануы арасындагы төр дәрәҗәсендәге корреляция анализы 2 нче рәсемдә күрсәтелгән. S9. Төс, төрле төрләр; өчпочмак, W + OSS1; турыпочмаклык, W + OSM; (C) Nicotiana JA һәм JA-Ile динамикасы OS кузгату амплитудасы буенча рейтингланган (ике яклы ANOVA һәм Tukey HSD күп тапкыр чагыштырудан соң, * P <0.05, ** P <0.01 һәм * ** W + OS һәм W + W чагыштыру өчен, P <0.001). Үлән ашаучы һәм метил JA (MeJA) моделен ясаганнан соң, һәр төрнең (D) төрлелеге һәм (E) махсуслашуы графигы. Йолдызчык W + OS һәм W + W яки ланолин плюс W (Lan + W) яки Lan плюс MeJA (Lan + MeJa) һәм Lan контроле (ике яклы дисперсия анализы, аннары Tukey'ның HSD пост-хок күпсанлы чагыштыруы, *P<0.05, **P<0.01 һәм ***P<0.001) арасындагы әһәмиятле аерманы күрсәтә.
Икеләтелгән кластер ысулын кулланып, без 939 MS/MS (S1 мәгълүмат файлы) 9 модулен ачыкладык. Төрле эшкәртү белән яңадан конфигурацияләнгән MS/MS составы төрләр арасындагы төрле модульләр арасында бик нык аерылып тора (S8 рәсем). Hj (монда төр дәрәҗәсендәге γ-төрлелек дип атала) һәм δj ны күз алдына китерү төрле төрләрнең метаболик киңлектә бик төрле төркемнәргә туплануын күрсәтә, анда төр дәрәҗәсендәге бүленеш гадәттә кузгатуга караганда күбрәк күренә. N. сызыклы һәм N. obliquusтан кала, алар индукция эффектларының киң динамик диапазонын күрсәтәләр (5B рәсем). Киресенчә, N. purpurea һәм N. obtusifolia кебек төрләрдә дәвалауга метаболик җавап азрак күренә, ләкин метаболом төрлерәк. Индукцияләнгән метаболик җавапның төрләргә хас бүленеше махсуслашу һәм гамма-төрлелек арасында сизелерлек тискәре корреляциягә китерде (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). JAs дәрәҗәсендәге OS китереп чыгарган үзгәрешләр метаболом махсуслашуы белән уңай корреляциягә ия һәм һәр төр күрсәткән метаболик гамма төрлелеге белән тискәре корреляциягә ия (5B рәсем һәм S9 рәсем). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, 5C рәсемдә "сигнал җавап бирү" төрләре дип аталган төрләр, мәсәлән, Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute һәм Nepenthes attenuated, 30 минуттан соң сизелерлек билгеләр тудырды. Соңгы OS-га хас JA һәм JA-Ile эпидемияләре, ә "сигнал җавап бирми" дип аталган башка бактерияләр, мәсәлән, Nepenthes mills, Nepenthes powdery һәм N. obtusifolia, OS спецификасы булмаганда гына JA-Ile Edge индукциясен күрсәтә (5C рәсем). Метаболик дәрәҗәдә, югарыда әйтелгәнчә, сүнгән Nepenthes өчен, сигнал җавап бирүче матдәләр OS спецификасын күрсәттеләр һәм δj ны сизелерлек арттырдылар, шул ук вакытта Hj ны киметтеләр. Бу OS-га хас прайминг эффекты сигналга реактив булмаган төрләр дип классификацияләнгән төрләрдә ачыкланмады (5 нче рәсем, D һәм E). OS-га хас метаболитлар сигналга җавап бирүче төрләр арасында ешрак бүленә, һәм бу сигналлар сигналга зәгыйфьрәк җавап бирүче төрләр белән туплана, ә сигналга зәгыйфьрәк җавап бирүче төрләр азрак бәйләнеш күрсәтә (S8 нче рәсем). Бу нәтиҗә JA-ларның OS-га хас индукциясе һәм аскы агым метаболомының OS-га хас реконфигурациясе төр дәрәҗәсендә бәйләнгәнен күрсәтә.
Аннары, без үсемлекләрне эшкәртү өчен метил JA (MeJA) булган ланолин пастасын кулландык, бу бәйләнеш режимнары үсемлекләр цитоплазмасында булачак экзоген JA тарафыннан кулланыла торган JA булуы белән чикләнгәнме-юкмы икәнен тикшердек. Тиз деэстерификация - JA. Без JAның өзлексез бирелүе аркасында сигналга җавап бирүче төрләрдән сигналга җавап бирмәүче төрләргә әкренләп үзгәрү тенденциясен таптык (5 нче рәсем, D һәм E). Кыскасы, MeJA белән дәвалау сызыклы нематодаларның, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens һәм N. mikimotoi метаболомнарын ныклы рәвештә яңадан программалаштырды, нәтиҗәдә δj сизелерлек артты һәм Hj кимүе булды. N. purpurea δj артуын гына күрсәтте, ләкин Hj артмады. Элегрәк JAларның бик түбән дәрәҗәсен туплавы күрсәтелгән N. obtusifolia да метаболомны яңадан конфигурацияләү ягыннан MeJA белән дәвалауга начар җавап бирә. Бу нәтиҗәләр сигналга җавап бирмәгән төрләрдә JA җитештерү яки сигнал трансдукциясе физиологик яктан чикләнгән булуын күрсәтә. Бу гипотезаны тикшерү өчен без W + W, W + OSM һәм W + OSS1 Транскриптомы (39) белән индукцияләнгән дүрт төрне (N. pallens, N. mills, N. pink һәм N. microphylla) өйрәндек. Метаболомны үзгәртү схемасына туры китереп, төрләр транскриптом киңлегендә яхшы аерылган, алар арасында N. attenuated иң югары OS белән индукцияләнгән RDPI күрсәтте, ә N. gracilis иң түбән күрсәткечкә ия иде (6А рәсем). Ләкин, N. oblonga тарафыннан индукцияләнгән транскриптом төрлелеге дүрт төр арасында иң түбән булуы ачыкланды, бу җиде төрдә элек күрсәтелгән N. oblongaның иң югары метабономик төрлелегенә каршы килә. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр күрсәткәнчә, иртә саклану сигналларына бәйле геннар җыелмасы, шул исәптән JA сигналлары, Nicotiana төрләрендә үлән ашаучы хайваннар белән бәйле эликторлар тарафыннан индукцияләнгән иртә саклану җавапларының спецификасын аңлата (39). Бу дүрт төр арасындагы JA сигнал юлларын чагыштыру кызыклы үрнәк күрсәтте (6B рәсем). Бу юлдагы күпчелек геннар, мәсәлән, AOC, OPR3, ACX һәм COI1, бу дүрт төрдә индукциянең чагыштырмача югары дәрәҗәсен күрсәттеләр. Ләкин, төп ген, JAR4, JAны биологик яктан актив JA-Ile тупланган транскрипт формасына әйләндерә, һәм аның транскрипция дәрәҗәсе бик түбән, бигрәк тә N. mills, Nepenthes pieris һәм N. microphylla'да. Моннан тыш, N. bifidum'да башка AOS генының транскрипты гына ачыкланмады. Ген экспрессиясендәге бу үзгәрешләр сигнал-анергик төрләрдә JA җитештерүнең түбән булуы һәм N. gracilis индукциясе аркасында барлыкка килгән экстремаль фенотиплар өчен җаваплы булырга мөмкин.
(A) Үлән ашаучы индукциядән соң 30 минуттан соң үрнәк алынган дүрт якын бәйләнешле тәмәке төренең иртә транскрипция җавапларын яңадан программалаштыруның мәгълүмат теориясе анализы. RDPI үлән ашаучы OS тарафыннан индукцияләнгән яфракларны яра контроле белән чагыштыру юлы белән исәпләнә. Төсләр төрле төрләрне, ә символлар төрле дәвалау ысулларын күрсәтә. (B) Дүрт төр арасында JA сигнал юлларында ген экспрессиясен анализлау. Гадиләштерелгән JA юлы рамка графигы янында күрсәтелгән. Төрле төсләр төрле эшкәртү ысулларын күрсәтә. Йолдызчык W + OS белән дәвалау һәм W + W контроле арасында зур аерма барлыгын күрсәтә (парлы аермалар өчен Студентның t-тест өчен, *P<0.05, **P<0.01 һәм ***P<0.001). OPDA, 12-оксофитодиен кислотасы; OPC-8: 0,3-оксо-2(2′(Z)-пентенил)-циклопентан-1-октан кислотасы.
Соңгы өлештә без төрле үсемлек төрләренең метаболомының бөҗәк төрләренә хас үзгәртеп коруының үлән ашаучыларга ничек чыдам булуын өйрәндек. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләрдә Nicotiana ыругы ассызыкланды. Аларның Ms һәм личинкаларга каршы торучанлыгы бик нык аерылып тора (40). Монда без бу модель һәм аларның метаболик пластиклыгы арасындагы бәйләнешне өйрәндек. Югарыда күрсәтелгән дүрт тәмәке төрен кулланып һәм үлән ашаучылар китереп чыгарган метаболомның төрлелеге һәм махсуслашуы белән үсемлекләрнең Ms һәм Sl га каршы торучанлыгы арасындагы корреляцияне сынап карап, без гомуми Sl All га каршы торучанлык, төрлелек һәм махсуслашуның уңай корреляцияләнгәнен ачыкладык, ә эксперт ханымнарга каршы торучанлык һәм махсуслашу арасындагы корреляция зәгыйфь, һәм төрлелек белән корреляция әһәмиятле түгел (S10 нчы рәсем). S1 каршылыгына килгәндә, элек JA сигнал трансдукция дәрәҗәләрен һәм метаболом пластиклыгын күрсәтүләре күрсәтелгән N. chinensis һәм N. gracilis ның үлән ашаучыларның индукциясенә бик төрле җаваплары булган, һәм алар шулай ук ​​охшаш югары каршылык күрсәткәннәр. Җенес.
Соңгы алтмыш ел эчендә үсемлекләрне саклау теориясе теоретик рамка тәкъдим итте, аның нигезендә тикшеренүчеләр үсемлекләрнең махсуслаштырылган метаболитларының шактый күп эволюциясен һәм функцияләрен фаразладылар. Бу теорияләрнең күбесе гадәти ныклы нәтиҗәләр процедурасына иярми (41). Алар төп фаразларны (3) бер үк анализ дәрәҗәсендә тәкъдим итәләр. Төп фаразларны тикшерү конкрет теорияләрне анализларга мөмкинлек биргәч, бу алга баруны тәэмин итәчәк. Ярдәм ителергә тиеш, ләкин башкаларны кире кагарга кирәк (42). Киресенчә, яңа теория төрле анализ дәрәҗәләрендә фаразлар ясый һәм тасвирламалы фикерләрнең яңа катламын өсти (42). Ләкин, функциональ дәрәҗәдә тәкъдим ителгән ике теорияне, MT һәм OD, үлән ашаучылар китереп чыгарган махсуслаштырылган метаболик үзгәрешләрнең мөһим фаразлары буларак җиңел аңлатырга мөмкин: OD теориясе махсуслаштырылган метаболик "киңлектәге" үзгәрешләрнең югары юнәлешле булуына ышана. MT теориясе бу үзгәрешләрнең юнәлешсез һәм метаболик киңлектә очраклы урнашачагына һәм югары саклану кыйммәтенә ия метаболитларга ия булачагына ышана. OD һәм MT фаразларының элеккеге тикшерүләре априор "саклану" кушылмаларының тар җыелмасын кулланып тикшерелде. Бу метаболит-үзәкле тестлар үлән ашау вакытында метаболомның яңадан конфигурацияләнү дәрәҗәсен һәм траекториясен анализлау мөмкинлеген чикли һәм даими статистик кысалар эчендә сынауларга мөмкинлек бирми, алар гомуми дип саналырга мөмкин булган төп фаразларны таләп итә. Үсемлек метаболомындагы үзгәрешләрне санлы рәвештә билгеләү. Монда без метаболомикада исәпләү MS нигезендә инновацион технологияне кулландык һәм глобаль метаболомика дәрәҗәсендә тәкъдим ителгән икесе арасындагы аерманы тикшерү өчен мәгълүмат теориясе дескрипторларының гомуми валютасында деконволюция MS анализын үткәрдек. Бу теориянең төп фаразы. Мәгълүмат теориясе күп өлкәләрдә, бигрәк тә биологик төрлелек һәм туклыклы матдәләр агымын тикшерү контекстында кулланылды (43). Ләкин, без белгәнчә, бу үсемлекләрнең метаболик мәгълүмат киңлеген тасвирлау һәм әйләнә-тирә мохит сигналларына җавап итеп вакытлыча метаболик үзгәрешләргә бәйле экологик проблемаларны чишү өчен кулланылган беренче кулланылыш. Аерым алганда, бу ысулның мөмкинлеге үсемлек төрләре эчендәге һәм алар арасындагы үрнәкләрне чагыштыру сәләтендә, үлән ашаучыларның төрле төрләрдән төрара макроэволюцион үрнәкләргә эволюциясенең төрле дәрәҗәләрендә ничек эволюцияләнгәнен тикшерүдә. Метаболизм.
Төп компонент анализы (ТКА) күп үзгәрүчәнле мәгълүматлар җыелмасын үлчәмлелекне киметү киңлегенә үзгәртә, шуңа күрә мәгълүматларның төп тенденциясен аңлатып була, шуңа күрә ул гадәттә мәгълүматлар җыелмасын анализлау өчен тикшеренү ысулы буларак кулланыла, мәсәлән, деконволюция метаболомы. Ләкин, үлчәмлелекне киметү мәгълүматлар җыелмасындагы мәгълүмат эчтәлегенең бер өлешен югалтачак, һәм ТКА экологик теория өчен аеруча мөһим булган үзенчәлекләр турында санлы мәгълүмат бирә алмый, мәсәлән: үлән ашаучылар махсуслаштырылган өлкәләрдә (мәсәлән, байлык, таралыш) һәм күплек) метаболитларда төрлелекне ничек яңадан конфигурациялиләр? Кайсы метаболитлар билгеле бер үлән ашаучының индукцияләнгән халәтен фаразлаучылар булып тора? Спецификлык, төрлелек һәм индуктивлык ягыннан, яфракларга хас метаболит профиленең мәгълүмат эчтәлеге таркала, һәм үлән ашаучыларны ашау специфик метаболизмны активлаштыра ала. Көтелмәгәнчә, без күзәттек, гамәлгә ашырылган мәгълүмат теориясе күрсәткечләрендә тасвирланганча, ике үлән ашаучы хайванның (төнлә ашатучы гомуми Sl) һәм Solanaceae белгече Ms һөҗүмнәреннән соң метаболик хәл зур кабатлануга ия. Аларның туклану тәртибе һәм концентрациясе шактый аерылып торса да. OS'та май кислотасы-аминокислота конъюгаты (FAC) инициаторы (31). Стандартлаштырылган тишек яраларын дәвалау өчен үлән ашаучы OS кулланып, симуляцияләнгән үлән ашаучы белән дәвалау да охшаш тенденция күрсәтте. Үсемлекләрнең үлән ашаучы хайван һөҗүмнәренә җавабын симуляцияләүнең бу стандартлаштырылган процедурасы үлән ашаучы хайваннарның ашау тәртибендәге үзгәрешләр аркасында килеп чыккан буталчык факторларны бетерә, бу төрле вакытта төрле дәрәҗәдәге зыянга китерә (34). OSM'ның төп сәбәбе буларак билгеле булган FAC, OSS1'да JAS һәм башка үсемлек гормоннары җавапларын киметә, ә OSS1 йөзләрчә тапкыр киметә (31). Ләкин, OSS1 OSM'га караганда JA туплануның охшаш дәрәҗәсенә китерде. Элегрәк көчсезләнгән Непентесларда JA җавабы OSMга бик сизгер булуы күрсәтелгән иде, анда FAC су белән 1:1000 нисбәтендә сыекландырылса да үз активлыгын саклый ала (44). Шуңа күрә, OSM белән чагыштырганда, OSS1дагы FAC бик түбән булса да, ул JA таралуын җитәрлек дәрәҗәдә китереп чыгару өчен җитәрлек. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр поринсыман аксымнарның (45) һәм олигосахаридларның (46) OSS1да үсемлекләрнең саклану реакцияләрен башлап җибәрү өчен молекуляр билгеләр буларак кулланылырга мөмкинлеген күрсәтте. Ләкин, OSS1дагы бу эликторларның хәзерге тикшеренүдә күзәтелгән JA туплануы өчен җаваплы булу-булмавы әлегә ачык түгел.
Төрле үлән ашаучыларны яки экзоген JA яки SA (салицил кислотасы) куллану нәтиҗәсендә килеп чыккан дифференциаль метаболик бармак эзләрен сурәтләүче тикшеренүләр аз булса да (47), үсемлек үләне челтәрендәге үлән ашаучылар төренә хас булган бозылуны һәм аның шәхси мәгълүматка йогынтысын беркем дә бозмаган. Метаболизмның гомуми йогынтысы системалы рәвештә өйрәнелә. Бу анализ JA'лардан тыш башка үсемлек гормоннары белән эчке гормон челтәре бәйләнешенең үлән ашаучылар китереп чыгарган метаболик үзгәртеп коруның спецификасын формалаштыруын тагын да раслады. Аерым алганда, без OSM китереп чыгарган ET'ның OSS1 китереп чыгарганга караганда күпкә югарырак булуын ачыкладык. Бу режим OSM'да күбрәк FAC күләме белән туры килә, бу ET шартлавын башлап җибәрү өчен кирәкле һәм җитәрлек шарт (48). Үсемлекләр һәм үлән ашаучылар арасындагы үзара бәйләнеш контекстында, ET'ның үсемлеккә хас метаболит динамикасына сигнал бирү функциясе әле дә спорадик һәм бары тик бер кушылма төркеменә генә юнәлтелгән. Моннан тыш, күпчелек тикшеренүләрдә ЭТны көйләүне өйрәнү өчен ЭТны яки аның прекурсорларын яки төрле ингибиторларны экзоген куллану кулланылган, алар арасында бу экзоген химик кулланулар күп кенә специфик булмаган ян эффектлар китереп чыгарачак. Безнең белүебезчә, бу тикшеренү үсемлек метаболом динамикасын координацияләү өчен бозылган трансген үсемлекләрне җитештерү һәм кабул итү өчен ЭТны куллануда ЭТ ролен беренче зур күләмле системалы тикшерү булып тора. Үлән ашаучы хайваннарга хас ЭТ индукциясе, нәтиҗәдә, метаболом реакциясен модуляцияли ала. Иң әһәмиятлесе - ЭТ биосинтезы (ACO) һәм кабул итү (ETR1) геннарын трансген манипуляцияләү, алар феноламидларның үлән ашаучы хайваннарга хас de novo туплануын ачыклады. Элегрәк ЭТ путресцин N-метилтрансферазаны көйләү юлы белән JA тарафыннан индукцияләнгән никотин туплануын көйли алуы күрсәтелгән иде (49). Ләкин, механик яктан караганда, ЭТ фенамид индукциясен ничек көйли икәне ачык түгел. ET сигнал трансдукция функциясеннән тыш, метаболик агымны полиаминофенол амидларына инвестицияләрне көйләү өчен S-аденозил-1-метионинга да юнәлтергә мөмкин. S-аденозил-1-метионин - ET һәм полиамин биосинтетик юлының уртак арадаш продукты. ET сигналының феноламид дәрәҗәсен көйләү механизмын өстәмә өйрәнү кирәк.
Озак вакыт дәвамында, билгесез структуралы махсус метаболитларның күп булуы аркасында, билгеле метаболик категорияләргә зур игътибар бирү биологик үзара бәйләнешләрдән соң метаболик төрлелекнең вакытлыча үзгәрешләрен төгәл бәяли алмады. Хәзерге вакытта, мәгълүмат теориясе анализына нигезләнеп, объектив метаболитларга нигезләнгән MS/MS спектрын алуның төп нәтиҗәсе шунда ки, үлән ашаучы хайваннар үлән ашау яки симуляцияләү белән яфрак метаболомының гомуми метаболик төрлелеген киметә, шул ук вакытта аның махсуслашу дәрәҗәсен арттыра. Үлән ашаучы хайваннар аркасында метаболомның бу вакытлыча артуы транскриптомның спецификлыгының синергетик артуы белән бәйле. Бу зуррак метаболом махсуслашуына иң зур өлеш кертүче үзенчәлек (югарырак Si кыйммәтенә ия) - элек характерланган үлән ашаучы функциясе булган махсус метаболит. Бу модель OD теориясен фаразлау белән туры килә, ләкин метаболомны яңадан программалаштыруның очраклылыгы белән бәйле MT фаразы туры килми. Ләкин, бу мәгълүматлар катнаш модель фаразлау белән дә туры килә (иң яхшы MT; 1B рәсем), чөнки билгесез саклану функцияләре булган башка характерланмаган метаболитлар әле дә очраклы Si бүленешен күзәтергә мөмкин.
Бу тикшеренүдә тагын да игътибарга лаеклы үрнәк шунда ки, микроэволюция дәрәҗәсеннән (бер үсемлек һәм тәмәке популяциясе) зуррак эволюцион масштабка (якын бәйләнешле тәмәке төрләре) кадәр, эволюцион оешманың төрле дәрәҗәләре "иң яхшы саклануда" тора. Үлән ашаучыларның сәләтләрендә зур аермалар бар. Мур һ.б. (20) һәм Кесслер һәм Калске (1) башта Уиттакер (50) тарафыннан аерылып торган өч функциональ биологик төрлелек дәрәҗәсен химик төрлелекнең конститутив һәм индукцияләнгән вакыт үзгәрешләренә әйләндерергә мөстәкыйль рәвештә тәкъдим иттеләр; бу авторлар икесе дә гомумиләштермәделәр. Зур күләмле метаболом мәгълүматларын җыю процедуралары шулай ук ​​бу мәгълүматлардан метаболик төрлелекне ничек исәпләүне күрсәтми. Бу тикшеренүдә Уиттакерның функциональ классификациясенә кечкенә төзәтмәләр α-метаболик төрлелекне билгеле бер үсемлектәге MS/MS спектрларының төрлелеге буларак, ә β-метаболик төрлелекне популяцияләр төркеменең төп төр эчендәге метаболизмы буларак караячак. Фаза, һәм γ-метаболик төрлелек охшаш төрләрне анализлауның киңәйтүе булачак.
JA сигналы үлән ашаучы хайваннарның төрле метаболик реакцияләре өчен бик мөһим. Шулай да, JA биосинтезының төр эчендәге регуляциясенең метаболом төрлелегенә керткән өлешен катгый санлы тикшерү җитми, һәм JA сигналы югарырак макроэволюцион масштабта стресс китереп чыгарган метаболик диверсификация өчен гомуми урын булып торамы-юкмы икәнлеге әлегә ачык түгел. Без Nepenthes үлән ашаучысының үлән ашаучы табигате метаболом махсуслашуын китереп чыгаруын һәм Nicotiana төрләре популяциясендә һәм якын туган Nicotiana төрләре арасында метаболом махсуслашуының үзгәрүе JA сигнализациясе белән системалы рәвештә уңай корреляцияләнгәнен күзәттек. Моннан тыш, JA сигналы бозылганда, бер генотип үлән ашаучы тарафыннан китереп чыгарылган метаболик спецификлык юкка чыгачак (3 нче рәсем, C һәм E). Табигый рәвештә сүнгән Nepenthes популяцияләренең метаболик спектр үзгәрешләре күбесенчә санлы булганлыктан, бу анализда метаболик β төрлелеге һәм спецификлыгындагы үзгәрешләр күбесенчә метаболитларга бай кушылма категорияләренең көчле кузгатуыннан килеп чыгарга мөмкин. Бу кушылма сыйныфлары метаболом профиленең бер өлешен тәшкил итә һәм JA сигналлары белән уңай корреляциягә китерә.
Тәмәке төренә якын булган биохимик механизмнар бик төрле булганлыктан, метаболитлар сыйфат аспектында аерым билгеләнә, шуңа күрә ул аналитикрак. Мәгълүмат теориясенең тотылган метаболик профильне эшкәртүе үлән ашаучы индукция метаболик гамма төрлелеге һәм махсуслашу арасындагы компромиссны көчәйтә икәнен күрсәтә. JA сигналы бу компромисста төп роль уйный. Метаболом махсуслашуының артуы төп OD фаразына туры килә һәм JA сигналы белән уңай корреляцияләнә, ә JA сигналы метаболик гамма төрлелеге белән тискәре корреляцияләнә. Бу модельләр үсемлекләрнең OD сыйдырышлыгы, нигездә, микроэволюцион масштабта яки зуррак эволюцион масштабта булсын, JA пластиклыгы белән билгеләнә икәнен күрсәтә. JA биосинтезы кимчелекләрен урап үтүче экзоген JA куллану экспериментлары, якын бәйле тәмәке төрләрен сигналга җавап бирүче һәм сигналга җавап бирмәүче төрләргә аерырга мөмкин булуын күрсәтә, аларның JA режимы һәм үлән ашаучылар тарафыннан индукцияләнгән метаболом пластиклыгы кебек үк. Сигналга җавап бирмәүче төрләр эндоген JA җитештерә алмау сәбәпле җавап бирә алмыйлар һәм шуңа күрә физиологик чикләүләргә дучар булалар. Бу JA сигнал юлындагы кайбер төп геннардагы мутацияләр аркасында килеп чыгарга мөмкин (N. crescens'тагы AOS һәм JAR4). Бу нәтиҗә бу төрара макроэволюцион үрнәкләрнең, нигездә, эчке гормоннарны кабул итү һәм җавап бирүдәге үзгәрешләр белән бәйле булуын күрсәтә.
Үсемлекләр һәм үлән ашаучылар арасындагы үзара бәйләнештән тыш, метаболик төрлелекне өйрәнү әйләнә-тирә мохиткә биологик адаптацияне һәм катлаулы фенотипик билгеләрнең эволюциясен тикшерүдәге барлык мөһим теоретик казанышлар белән бәйле. Заманча MS кораллары белән алынган мәгълүмат күләме арту белән, метаболик төрлелек турындагы гипотезаларны тикшерү хәзер шәхси/категория метаболитлары аермаларын узып китә һәм көтелмәгән үрнәкләрне ачыклау өчен глобаль анализ үткәрә ала. Зур масштаблы анализ процессында мөһим метафора - мәгълүматларны өйрәнү өчен кулланылырга мөмкин булган мәгънәле карталар уйлап табу идеясе. Шуңа күрә, объектив MS/MS метаболомикасы һәм мәгълүмат теориясенең хәзерге берләшмәсенең мөһим нәтиҗәсе - ул төрле таксономик масштабларда метаболик төрлелекне карау өчен карталар төзү өчен кулланылырга мөмкин булган гади метрика бирә. Бу методның төп таләбе. Микро/макро эволюцияне һәм җәмгыять экологиясен өйрәнү.
Макроэволюцион дәрәҗәдә, Эрлих һәм Рейвенның (51) үсемлек-бөҗәк бергәләп эволюция теориясенең төп максаты - төрләр арасындагы метаболик төрлелекнең үзгәрүе үсемлек нәселләренең диверсификацияләнү сәбәбе булуын фаразлау. Ләкин, бу төп хезмәт бастырылганнан бирле илле ел эчендә бу гипотеза сирәк тикшерелде (52). Бу, нигездә, ерак арадагы үсемлек нәселләрендәге чагыштырма метаболик үзенчәлекләрнең филогенетик үзенчәлекләре белән бәйле. Сирәклекне максатчан анализ ысулларын ныгыту өчен кулланырга мөмкин. Мәгълүмат теориясе белән эшкәртелгән хәзерге MS/MS эш агымы билгесез метаболитларның MS/MS структураль охшашлыгын санлы рәвештә күрсәтә (алдан метаболит сайламыйча) һәм бу MS/MSларны MS/MS җыелмасына әйләндерә, шулай итеп профессиональ метаболизмда Бу макроэволюцион модельләр классификация масштабында чагыштырыла. Гади статистик күрсәткечләр. Процесс филогенетик анализга охшаш, ул алдан фаразламыйча диверсификация тизлеген яки характер эволюциясен санлы рәвештә билгеләү өчен эзлеклелек тигезләүен куллана ала.
Биохимик дәрәҗәдә, Фирн һәм Джонсның скрининг гипотезасы (53) күрсәткәнчә, метаболик төрлелек төрле дәрәҗәләрдә саклана, бу элек бәйләнешсез яки алыштырылган метаболитларның биологик активлыгын күрсәтү өчен чимал белән тәэмин итү өчен кирәк. Мәгълүмат теориясе ысуллары метаболит махсуслашуы вакытында барлыкка килгән бу метаболитларга хас эволюцион күчешләрне тәкъдим ителгән эволюцион скрининг процессының бер өлеше буларак санлаштырырга мөмкин булган рамканы тәэмин итә: түбән спецификлыктан югары спецификлыкка кадәр биологик актив адаптация. Билгеле бер мохитнең ингибирланган метаболитлары.
Гомумән алганда, молекуляр биологиянең башлангыч чорында үсемлекләрне саклауның мөһим теорияләре эшләнгән, һәм дедуктив гипотезага нигезләнгән ысуллар фәнни алгарышның бердәнбер чарасы дип санала. Бу, нигездә, бөтен метаболомны үлчәүнең техник чикләүләре белән бәйле. Гипотезага нигезләнгән ысуллар, аеруча, башка сәбәп механизмнарын сайлауда файдалы булса да, аларның биохимик челтәрләрне аңлавыбызны алга этәрү мөмкинлеге хәзерге вакытта мәгълүматларга бай фәндә кулланыла торган исәпләү ысулларына караганда чикләнгәнрәк. Шуңа күрә, фаразлап булмый торган теорияләр, мөмкин булган мәгълүматлар чикләреннән күпкә читтә, шуңа күрә тикшеренү өлкәсендәге алгарышның гипотетик формуласы/тест циклын юкка чыгарып булмый (4). Без монда кертелгән метаболомиканың исәпләү эш процессы метаболик төрлелекнең соңгы (ничек) һәм соңгы (ни өчен) мәсьәләләренә кызыксынуны яңадан уята ала һәм теоретик яктан җитәкчелек ителгән мәгълүмат фәненең яңа чорына өлеш кертә ала дип фаразлыйбыз. Бу чор алдагы буыннарны рухландырган мөһим теорияләрне яңадан тикшерде.
Турыдан-туры үлән ашаучы хайваннар белән туклану бер роза чәчәге үсемлегенең бер ачык төстәге кувшин яфрагында икенче яшь личинкасын яки Sl личинкасын үстерү юлы белән башкарыла, һәр үсемлектә 10 үсемлек кабатлануы була. Бөҗәк личинкалары кыскычлар белән кысылган, ә калган яфрак тукымасы инфекциядән соң 24 һәм 72 сәгатьтән соң җыелган һәм тиз туңдырылган, һәм метаболитлар экстракцияләнгән.
Үлән ашаучы хайваннарны эшкәртүне югары дәрәҗәдә синхронлаштырылган ысул белән симуляцияләгез. Метод - тукыма бизәкләре ярдәмендә тукыма гирляндасының үсеш этабында үсемлекнең өч тулысынча таралган яфрагының урта кабыргасының һәр ягында өч рәт чәнечкеләрне тишү һәм шунда ук 1:5 сыекландырылган MS куллану. Яисә перчаткалы бармаклар ярдәмендә тишек ярасына S1 OS кертү. Яфракны югарыда тасвирланганча җыеп алыгыз һәм эшкәртегез. Беренчел метаболитларны һәм үсемлек гормоннарын алу өчен алдан тасвирланган ысулны кулланыгыз (54).
Экзоген JA куллану өчен, һәр төрдәге алты роза чәчәге үсемлегенең өч яфрак яфрагы 150 мкг MeJA (Lan + MeJA) булган 20 мкл ланолин пастасы һәм 20 мкл ланолин һәм яра эшкәртүе (Lan + W) белән эшкәртелә, яисә контроль буларак 20 мкл саф ланолин кулланыла. Яфраклар эшкәртүдән соң 72 сәгатьтән соң җыела, сыек азотта туңдырыла һәм кулланылганчы -80°C температурада саклана.
Безнең тикшеренү төркемендә дүрт JA һәм ET трансген линиясе, атап әйткәндә, irAOC (36), irCOI1 (55), irACO һәм sETR1 (48) ачыкланды. irAOC JA һәм JA-Ile дәрәҗәләренең нык кимүен күрсәтте, ә irCOI1 JA'ларга сизгер түгел иде. EV белән чагыштырганда, JA-Ile туплануы артты. Шулай ук, irACO ET җитештерүне киметәчәк, һәм EV белән чагыштырганда, ET'га сизгер булмаган sETR1 ET җитештерүне арттырачак.
Инвазив булмаган рәвештә ЭТ үлчәүләрен башкару өчен фотоакустик лазер спектрометры (Sensor Sense ETD-300 реаль вакыт ЭТ сенсоры) кулланыла. Эшкәртүдән соң шунда ук яфракларның яртысы киселде һәм 4 мл ябык пыяла флаконга күчерелде, һәм баш киңлеге 5 сәгать эчендә тупланырга тиеш булды. Үлчәү вакытында һәр флакон 8 минут дәвамында сәгатенә 2 литр саф һава агымы белән юылды, ул алдан Sensor Sense тарафыннан бирелгән катализатор аша үтеп, CO2 һәм суны чыгарды.
Микрочип мәгълүматлары башта (35) формуласында бастырылган һәм Милли Биотехнология Мәгълүматы Үзәгенең (NCBI) Ген Экспрессиясе Комплекслы Мәгълүматлар Базасында (керү номеры GSE30287) сакланган. Бу тикшеренү өчен W + OSM белән эшкәртү нәтиҗәсендә барлыкка килгән яфракларга һәм зыян күрмәгән контрольгә туры килә торган мәгълүматлар алынган. Чимал интенсивлык log2. Статистик анализ алдыннан, башлангыч сызык R программа пакетын кулланып 75 нче процентильгә кадәр үзгәртелгән һәм нормальләштерелгән.
Nicotiana төрләренең башлангыч РНК секвенирлау (РНК-секвенция) мәгълүматлары NCBI Кыска уку архивларыннан (SRA) алынган, проект номеры PRJNA301787, ул Чжоу һ.б. тарафыннан хәбәр ителгән (39) һәм (56) да тасвирланганча дәвам итә. Бу тикшеренүдә анализ өчен Nicotiana төрләре өчен W + W, W + OSM һәм W + OSS1 белән эшкәртелгән чимал мәгълүматлар сайланган һәм түбәндәгечә эшкәртелгән: Беренчедән, чимал РНК-секвенция укулары FASTQ форматына үзгәртелгән. HISAT2 FASTQны SAMга үзгәртә, ә SAMtools SAM файлларын сортланган BAM файлларына үзгәртә. StringTie ген экспрессиясен исәпләү өчен кулланыла, һәм аның экспрессия ысулы шунда ки, һәр миллион секвенирланган транскрипция фрагментына мең база фрагментына фрагмент туры килә.
Анализда кулланылган Acclaim хроматографик колонкасы (150 мм x 2,1 мм; кисәкчәләр зурлыгы 2,2 мкм) һәм 4 мм x 4 мм саклагыч колонкасы бер үк материалдан тора. Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) системасында түбәндәге икелекле градиент кулланыла: 0 - 0,5 минут, изократик 90% A [деионизацияләнгән су, 0,1% (v/v) ацетонитрил һәм 0,05% кубыз кислотасы], 10% B (ацетонитрил һәм 0,05% кубыз кислотасы); 0,5 - 23,5 минут, градиент фазасы 10% A һәм 90% B, тиешенчә; 23,5 - 25 минут, изократик 10% A һәм 90% B. Агым тизлеге 400 мкл/мин. Барлык MS анализлары өчен, колонка элюентын уңай ионлашу режимында эшләүче электроспрей чыганагы белән җиһазландырылган квадруполь һәм очыш вакыты (qTOF) анализаторына кертегез (капилляр көчәнеше, 4500 В; капилляр чыгу урыны 130 В; киптерү температурасы 200°C; киптерү һава агымы 10 литр/мин).
Гомуми ачыкланучы метаболик профиль турында структураль мәгълүмат алу өчен, мәгълүматлардан мөһим булмаган яки аерылгысыз MS / MS фрагмент анализын (алга таба MS / MS дип атала) үткәрегез. Аерылмаган MS/MS ысулы концепциясе квадрупольнең бик зур масса изоляциясе тәрәзәсенә ия булуына нигезләнә [шуңа күрә барлык масса-заряд нисбәте (m/z) сигналларын фрагментлар дип карагыз]. Шуңа күрә, Impact II җайланмасы CE авышлыгын булдыра алмаганлыктан, бәрелеш нәтиҗәсендә барлыкка килгән диссоциация бәрелеш энергиясе (CE) кыйммәтләрен кулланып, берничә бәйсез анализ үткәрелде. Кыскасы, башта үрнәкне UHPLC-электроспрей ионизациясе/qTOF-MS ярдәмендә бер масса-спектрометрия режимын (чыганак эчендәге фрагментация нәтиҗәсендә барлыкка килгән түбән фрагментация шартлары) кулланып анализлагыз, m/z 50 дән 1500 гә кадәр 5 Гц кабатлау ешлыгында сканерлагыз. MS/MS анализы өчен бәрелеш газы буларак азотны кулланыгыз һәм түбәндәге дүрт төрле бәрелеш нәтиҗәсендә барлыкка килгән диссоциация көчәнешендә бәйсез үлчәүләр үткәрегез: 20, 30, 40 һәм 50 эВ. Үлчәү процессы дәвамында квадрупольнең масса изоляциясе тәрәзәсе иң зур, м/з 50 дән 1500 гә кадәр. Алгы корпус м/з һәм изоляция киңлеге эксперименты 200 гә куелганда, масса диапазоны җайланманың эш программасы һәм 0 Да тарафыннан автоматик рәвештә активлаштырыла. Бер масса режимындагы кебек масса кисәкләрен сканерлагыз. Масса калибрлау өчен натрий форматын (50 мл изопропанол, 200 мкл формик кислота һәм 1 мл 1М NaOH су эремәсе) кулланыгыз. Bruker югары төгәллекле калибрлау алгоритмын кулланып, мәгълүмат файлы билгеле бер вакыт аралыгында уртача спектрны эшләтеп җибәргәннән соң калибрлана. Чимал мәгълүмат файлын NetCDF форматына әйләндерү өчен Data Analysis v4.0 программасының (Brook Dalton, Бремен, Германия) экспорт функциясен кулланыгыз. MS/MS мәгълүмат җыелмасы ачык метаболомика мәгълүмат базасы MetaboLights (www.ebi.ac.uk) керү номеры белән сакланган. MTBLS1471.
MS/MS ассемблерациясен түбән һәм югары бәрелеш энергиясе һәм яңа гамәлгә ашырылган кагыйдәләр өчен MS1 һәм MS/MS сыйфат сигналлары арасындагы корреляция анализы аша гамәлгә ашырырга мөмкин. R скрипты прекурсорның продуктка таралуының корреляция анализын гамәлгә ашыру өчен кулланыла, ә кагыйдәләрне гамәлгә ашыру өчен C# скрипты (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) кулланыла.
Фон шау-шуыннан килеп чыккан ялган уңай хаталарны һәм берничә үрнәктә генә билгеле m/z үзенчәлекләрен ачыклау нәтиҗәсендә килеп чыккан ялган корреляцияне киметү өчен, без R пакеты XCMSның "тулы пик" функциясен кулланабыз (фон шау-шуын төзәтү өчен). "NA" (билгеләнмәгән пик) интенсивлыгын алыштыру өчен кулланылырга тиеш. Тулы пик функциясе кулланылганда, мәгълүматлар җыелмасында корреляция исәпләүенә тәэсир итәчәк күп "0" интенсивлык кыйммәтләре кала. Аннары, тулы пик функциясе кулланылганда һәм тулы пик функциясе кулланылмаганда алынган мәгълүматларны эшкәртү нәтиҗәләрен чагыштырабыз һәм уртача төзәтелгән исәпләнгән кыйммәт нигезендә фон шау-шу кыйммәтен исәплибез, аннары бу 0 интенсивлык кыйммәтләрен исәпләнгән фон кыйммәте белән алыштырабыз. Шулай ук, интенсивлыгы фон кыйммәтеннән өч тапкыр арткан үзенчәлекләрне генә исәпкә алдык һәм аларны "чын пиклар" дип санадык. PCC исәпләүләре өчен, кимендә сигез чын пиклы үрнәк прекурсорының (MS1) һәм фрагмент мәгълүматлар җыелмасының m/z сигналлары гына исәпкә алына.
Әгәр дә бөтен үрнәктәге прекурсор сыйфат үзенчәлегенең интенсивлыгы түбән яки югары бәрелеш энергиясенә дучар ителгән шул ук сыйфат үзенчәлегенең кимегән интенсивлыгы белән сизелерлек корреляцияләнгән булса, һәм үзенчәлек CAMERA тарафыннан изотоп пигы дип билгеләнмәсә, аны өстәмә рәвештә билгеләргә мөмкин. Аннары, 3 секунд эчендә барлык мөмкин булган прекурсор-продукт парларын исәпләп (пикы саклап калу өчен исәпләнгән саклау вакыты тәрәзәсе), корреляция анализы үткәрелә. m/z кыйммәте прекурсор кыйммәтеннән түбәнрәк булганда һәм MS/MS фрагментациясе ул алынган прекурсор белән бер үк үрнәк урынында мәгълүматлар җыелмасында булганда гына, ул фрагмент дип санала.
Бу ике гади кагыйдәгә нигезләнеп, без билгеләнгән прекурсорның m/z кыйммәтеннән зуррак булган m/z кыйммәтләре белән күрсәтелгән фрагментларны чыгарып ташлыйбыз һәм прекурсор һәм күрсәтелгән фрагментның күренгән үрнәк позициясенә нигезләнәбез. Шулай ук ​​MS1 режимында барлыкка килгән күп чыганак фрагментлары тарафыннан барлыкка китерелгән сыйфат үзенчәлекләрен кандидат прекурсорлар буларак сайларга мөмкин, шуның белән артык MS/MS кушылмалары барлыкка килә. Бу мәгълүмат артыклыгын киметү өчен, әгәр спектрларның NDP охшашлыгы 0,6 дан артса һәм алар CAMERA белән аңлатылган хроматограмма "pcgroup"ка карый икән, без аларны берләштерәчәкбез. Ниһаять, без прекурсор һәм фрагментлар белән бәйле барлык дүрт CE нәтиҗәләрен төрле бәрелеш энергияләрендә бер үк m/z кыйммәтенә ия булган барлык кандидат пиклары арасында иң югары интенсивлык пигын сайлап, соңгы деконволюцияләнгән композит спектрга берләштерәбез. Киләсе эшкәртү адымнары композит спектр концепциясенә нигезләнә һәм фрагментация ихтималын максимальләштерү өчен кирәкле төрле CE шартларын исәпкә ала, чөнки кайбер фрагментларны билгеле бер бәрелеш энергиясе астында гына ачыкларга мөмкин.
Метаболик профильнең индуктивлыгын исәпләү өчен RDPI (30) кулланылды. Метаболик спектр төрлелеге (Hj индексы) Мартинес һ.б. (8) тарафыннан тасвирланган түбәндәге тигезләмә ярдәмендә MS/MS ешлык бүленешенең Шеннон энтропиясен кулланып, MS/MS прекурсорларының күплегеннән алына. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), монда Pij j-нче үрнәктәге i-нче MS/MS чагыштырма ешлыгына туры килә (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Метаболик спецификлык (Si индексы) каралган үрнәкләр арасындагы ешлыкка карата бирелгән MS/MS чагылышының охшашлыгы буларак билгеләнә. MS/MS спецификлыгы Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi) буларак исәпләнә.
Һәр j үрнәгенең метаболомга хас δj индексын һәм MS/MS спецификлыгының уртача күрсәткечен үлчәү өчен түбәндәге формуланы кулланыгыз: δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS спектрлары парлар белән тигезләнгән, һәм охшашлык ике балл нигезендә исәпләнә. Беренчедән, стандарт NDP (косинус корреляциясе ысулы буларак та билгеле) кулланып, спектрлар арасындагы сегмент охшашлыгын бәяләү өчен түбәндәге тигезләмәне кулланыгыз: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, монда S1 һәм S2. Шуңа күрә, 1 нче спектр һәм 2 нче спектр, шулай ук ​​WS1, i һәм WS2 өчен, i ике спектр арасындагы i нче уртак пик аермасы 0,01 Da дан кимрәк булган пик интенсивлыгына нигезләнгән авырлыкны күрсәтә. Авырлык түбәндәгечә исәпләнә: W = [пик интенсивлыгы] m [сыйфат] n, m = 0,5, n = 2, MassBank тәкъдим иткәнчә.
Икенче балл кую ысулы кулланылды, ул MS/MS арасында уртак NL анализын үз эченә алды. Моның өчен без MS фрагментациясе процессында еш очрый торган 52 NL исемлеген бергә кулландык, һәм алдан зәгыйфьләнгән Nepenthes төрләренең икенчел метаболитларының MS/MS спектры өчен аңлатма бирелгән тагын да конкретрак NL (S1 мәгълүмат файлы) кулландык (9, 26). Һәр MS/MS өчен 1 һәм 0 икеле вектор булдырыгыз, бу кайбер NLларның хәзерге һәм булмаган вакытына туры килә. Евклид ераклыгы охшашлыгына нигезләнеп, NL охшашлык баллы һәр икеле NL векторлары пары өчен исәпләнә.
Икеләтә кластерлаштыруны башкару өчен, без DiffCoEx R пакетын кулландык, ул Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA) киңәйтүенә нигезләнгән. MS/MS спектрларының NDP һәм NL балллау матрицаларын кулланып, без DiffCoEx кулланып чагыштырма корреляция матрицасын исәпләдек. Икеле кластерлаштыру "cutreeDynamic" параметрын method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T һәм minClusterSize = 10 итеп кую юлы белән башкарыла. DiffCoExның R чыганак коды Tesson һ.б. тарафыннан өстәмә 1 нче файлдан йөкләнгән (57); Кирәкле R WGCNA программа пакетын https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA сайтында табарга мөмкин.
MS/MS молекуляр челтәр анализын үткәрү өчен, без NDP һәм NL охшашлык төрләренә нигезләнеп парлы спектраль тоташуны исәпләдек һәм CyFilescape yFiles макет алгоритмы киңәйтү кушымтасында органик макет кулланып челтәр топологиясен визуализацияләү өчен Cytoscape программасын кулландык.
Мәгълүматлар буенча статистик анализ үткәрү өчен R 3.0.1 версиясен кулланыгыз. Статистик әһәмият ике яклы дисперсия анализы (ANOVA) ярдәмендә бәяләнде, аннары Тукиның чыннан да әһәмиятле аерма (HSD) пост-хок тесты үткәрелде. Үлән ашаучы белән дәвалау һәм контроль арасындагы аерманы анализлау өчен, бер үк дисперсияле ике төркем үрнәкнең ике яклы бүленеше Стьюдентның t тесты ярдәмендә анализланды.
Бу мәкалә өчен өстәмә материаллар белән http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1 сылтамасы буенча танышырга мөмкин.
Бу - Creative Commons Attribution-Nocommercial License шартлары нигезендә таратылган ачык керү мөмкинлеге булган мәкалә, ул теләсә нинди материалда кулланырга, таратырга һәм күчереп алырга мөмкинлек бирә, ләкин соңгы куллану коммерция максатларында булмаган һәм төп эш дөрес булган очракта. Сылтама.
Искәрмә: Без сездән электрон почта адресыгызны гына сорыйбыз, шуңа күрә сез биткә тәкъдим иткән кеше сезнең электрон хатны күрүен теләвегезне һәм аның спам түгеллеген белсен. Без бернинди электрон почта адресларын да теркәмәячәкбез.
Бу сорау сезнең кунак булу-булмавыгызны тикшерү һәм спамның автоматик рәвештә җибәрелүен булдырмау өчен кулланыла.
Мәгълүмат теориясе махсус метаболомнарны чагыштыру һәм тестлардан саклану теорияләрен фаразлау өчен универсаль валюта бирә.
Мәгълүмат теориясе махсус метаболомнарны чагыштыру һәм тестлардан саклану теорияләрен фаразлау өчен универсаль валюта бирә.
© 2021 Фән үсеше өчен Америка Ассоциациясе. барлык хокуклар сакланган. AAAS - HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef һәм COUNTER партнеры. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.