Мәкалә "Кузаклы үсемлекләрнең патогеннарга һәм корткычларга каршы торучанлыгын арттыру" тикшеренү темасының бер өлеше, барлык 5 мәкаләне дә карагыз.
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary гөмбәчек үсемлекләренең некрозы аркасында барлыкка килгән авыруның сәбәпчесе төрле хуҗа үсемлекләрен зарарлау өчен күп катламлы стратегия куллана. Бу тикшеренүдә Pseudomonas sclerotiorum китереп чыгарган ак гөмбәгә Phaseolus vulgaris L. молекуляр, физиологик һәм биохимик җавапларын көчәйтү өчен альтернатив дәвалау стратегиясе буларак, башка мөһим аминокислоталар синтезын стимуллаштыра торган диамин L-орнитин куллану тәкъдим ителә. In vitro экспериментлар күрсәткәнчә, L-орнитин дозага бәйле рәвештә S. pyrenoidosa мицелиаль үсешен сизелерлек тоткарлый. Моннан тыш, ул парник шартларында ак гөмбәнең авырлыгын сизелерлек киметә ала. Моннан тыш, L-орнитин эшкәртелгән үсемлекләрнең үсешен стимуллаштырды, бу L-орнитинның тикшерелгән концентрацияләренең эшкәртелгән үсемлекләр өчен фитотоксик түгеллеген күрсәтә. Моннан тыш, L-орнитин ферментатив булмаган антиоксидантларның (тулы эри торган феноллар һәм флавоноидлар) һәм ферментатив антиоксидантларның (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) һәм полифенол оксидаза (PPO)) экспрессиясен көчәйтте, һәм өч антиоксидант белән бәйле генның (PvCAT1, PvSOD һәм PvGR) экспрессиясен арттырды. Моннан тыш, кремний анализында S. sclerotiorum геномында фаразланган оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) аксымы барлыгы ачыкланды, ул функциональ анализ, сакланган доменнар һәм топология ягыннан Aspergillus fijiensis (AfOAH) һәм Penicillium sp. (PlOAH) оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) аксымнарына бик охшаш иде. Кызыклысы шунда ки, бәрәңге декстрозасы шулпасы (PDB) мохитенә L-орнитин өстәү S. sclerotiorum мицелийында SsOAH генының экспрессиясен сизелерлек киметте. Шулай ук, L-орнитинны экзоген куллану эшкәртелгән үсемлекләрдән җыелган гөмбә мицелийларында SsOAH генының экспрессиясен сизелерлек киметкән. Ниһаять, L-орнитин куллану PDB мохитендә дә, зарарланган яфракларда да оксалат кислотасы бүленешен сизелерлек киметкән. Нәтиҗә ясап шуны әйтергә мөмкин: L-орнитин зарарланган үсемлекләрнең оксидлашу-калыбына китерү статусын саклап калуда, шулай ук ​​саклану реакциясен көчәйтүдә төп роль уйный. Бу тикшеренү нәтиҗәләре ак гөмбәне контрольдә тоту һәм аның борчак җитештерүенә һәм башка культураларга йогынтысын киметү өчен инновацион, экологик яктан чиста ысуллар эшләүдә ярдәм итә ала.
Ак күгәрек, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary некротрофик гөмбәсе китереп чыгара, ул уңышны киметә торган, глобаль борчак (Phaseolus vulgaris L.) җитештерүгә җитди куркыныч тудыра торган авыру (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum - туфрак аша тарала торган гөмбәчек үсемлек патогеннарының берсе, аның киң диапазоны 600 дән артык үсемлек төреннән тора һәм хуҗа тукымаларын специфик булмаган ысул белән тиз арада мацерацияләү сәләтенә ия (Liang and Rollins, 2018). Начар шартларда ул үзенең тормыш циклының мөһим этабын уза, туфракта кара, каты, орлыксыман структуралар буларак озак вакыт йокы хәлендә кала, яки зарарланган үсемлекләрнең мицелийында яки сабак төбендә ак, мамыксыман үсентеләр рәвешендә яши (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum склеротияләр барлыкка китерә ала, бу аңа зарарланган басуларда озак вакыт яшәргә һәм авыру вакытында сакланырга мөмкинлек бирә (Schwartz et al., 2005). Склеротияләр туклыклы матдәләргә бай, туфракта озак вакыт саклана ала һәм аннан соңгы инфекцияләр өчен төп инокулум булып хезмәт итә (Schwartz et al., 2005). Уңайлы шартларда склеротияләр шыта һәм һавада тарала, алар үсемлекнең барлык җир өсте өлешләрен, шул исәптән чәчәкләрне, сабакларны яки бөртекләрне зарарлый ала (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum хуҗа үсемлекләрен зарарлау өчен күп баскычлы стратегия куллана, склеротиаль үрчүдән алып симптомнар үсешенә кадәр берничә координацияләнгән вакыйгаларны үз эченә ала. Башта S. sclerotiorum апотеция дип аталган гөмбә сыман структуралардан асылган споралар (аскоспоралар дип атала) җитештерә, алар һавада оча һәм зарарланган үсемлек калдыкларында хәрәкәтсез склеротияләргә әйләнә (Bolton et al., 2006). Аннары гөмбә үсемлек күзәнәк тышчасының pH дәрәҗәсен контрольдә тоту, ферментатив деградацияне һәм тукымаларга инвазияне стимуллаштыру һәм хуҗа үсемлекнең оксидлашу шартлавын бастыру өчен вирулентлык факторы булган оксалат кислотасын бүлеп чыгара (Hegedus and Rimmer, 2005), һәм хуҗа үсемлекнең оксидлашу шартлавын бастыру. Бу кислоталашу процессы үсемлек күзәнәк тышчасын көчсезләндерә, гөмбә күзәнәк тышчасын деградацияләүче ферментларның (CWDE) нормаль һәм нәтиҗәле эшләве өчен уңай мохит тудыра, патогенга физик киртәне узып, хуҗа тукымаларына үтеп керергә мөмкинлек бирә (Marciano et al., 1983). S. sclerotiorum үтеп кергәннән соң, полигалактуроназа һәм целлюлаза кебек берничә CWDE бүлеп чыгара, алар аның зарарланган тукымаларда таралуын җиңеләйтә һәм тукыма некрозына китерә. Зыяннарның һәм гифаль катламнарның үсеше ак гөмбәчекнең характерлы симптомнарына китерә (Hegedus һәм Rimmer, 2005). Шул ук вакытта, хуҗа үсемлекләре патоген белән бәйле молекуляр үрнәкләрне (PAMP) үрнәк тану рецепторлары (PRRs) аша таныйлар, нәтиҗәдә саклану җавапларын активлаштыра торган сигнал вакыйгалары сериясен башлап җибәрәләр.
Дистә еллар дәвамында авыруларны контрольдә тоту тырышлыкларына карамастан, борчакта, башка коммерция культураларындагы кебек үк, патогенның чыдамлыгы, исән калуы һәм җайлашуы аркасында җитәрлек чыдам гермоплазма җитми. Шуңа күрә авыруларны контрольдә тоту бик катлаулы һәм культура практикасын, биологик контрольне һәм химик фунгицидларны берләштергән комплекслы, күпкырлы стратегия таләп итә (O'Sullivan et al., 2021). Ак гөмбәгә каршы химик контроль иң нәтиҗәле, чөнки фунгицидлар, дөрес һәм дөрес вакытта кулланылганда, авыруның таралуын нәтиҗәле контрольдә тота, инфекциянең авырлыгын киметә һәм уңыш югалтуларын минимальләштерә ала. Ләкин, фунгицидларны артык куллану һәм аларга артык таяну S. sclerotiorumның чыдам штаммнары барлыкка килүенә китерергә һәм максатчан булмаган организмнарга, туфрак сәламәтлегенә һәм су сыйфатына тискәре йогынты ясарга мөмкин (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Шуңа күрә, экологик яктан чиста альтернативаларны табу иң мөһим бурычка әйләнде.
Путресцин, спермидин, спермин һәм кадаврин кебек полиаминнар (ПА) туфрак аша тарала торган үсемлек патогеннарына каршы өметле альтернатива булып хезмәт итә ала, шуның белән куркыныч химик фунгицидлар куллануны тулысынча яки өлешчә киметә (Нехела һ.б., 2024; Йи һ.б., 2024). Югары үсемлекләрдә ПА күп физиологик процессларда катнаша, шул исәптән, ләкин алар белән генә чикләнмичә, күзәнәк бүленеше, дифференциациясе һәм абиотик һәм биотик стрессларга җавап бирү (Киллини һәм Нехела, 2020). Алар антиоксидантлар булып эшли ала, реактив кислород төрләрен (ROS) чистартырга ярдәм итә, редокс гомеостазын саклый ала (Nehela һәм Killiny, 2023), саклануга бәйле геннарны стимуллаштыра ала (Romero һ.б., 2018), төрле метаболик юлларны көйли ала (Nehela һәм Killiny, 2023), эндоген фитогормоннарны модуляцияли ала (Nehela һәм Killiny, 2019), системалы алынган каршылыкны (SAR) булдыра ала һәм үсемлек-патоген үзара бәйләнешен көйли ала (Nehela һәм Killiny, 2020; Asija һ.б., 2022; Czerwoniec, 2022). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, үсемлекләрне саклауда ПАларның конкрет механизмнары һәм роле үсемлек төрләренә, патогеннарга һәм әйләнә-тирә мохит шартларына карап төрлечә була. Үсемлекләрдә иң күп очрый торган ПА мөһим полиамин L-орнитиннан биосинтезлана (Killiny һәм Nehela, 2020).
L-орнитин үсемлекләрнең үсеше һәм үсешендә күп роль уйный. Мәсәлән, алдагы тикшеренүләр күрсәткәнчә, дөгедә (Oryza sativa) орнитин азотны эшкәртү белән бәйле булырга мөмкин (Liu et al., 2018), дөге уңышы, сыйфаты һәм хуш исе (Lu et al., 2020) һәм су стрессына җавап бирү белән бәйле булырга мөмкин (Yang et al., 2000). Моннан тыш, L-орнитинны экзоген куллану шикәр чөгендерендә (Beta vulgaris) корылыкка чыдамлыкны сизелерлек арттырды (Hussein et al., 2019) һәм суган (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu һәм Çavuşoǧlu, 2021) һәм кешью (Anacardium occidentale) үсемлекләрендә тоз стрессын киметте (da Rocha et al., 2012). L-орнитинның абиотик стресстан сакланудагы потенциаль роле эшкәртелгән үсемлекләрдә пролин туплануында катнашуы белән бәйле булырга мөмкин. Мәсәлән, пролин метаболизмы белән бәйле геннар, мәсәлән, орнитин дельта аминотрансфераза (дельта-OAT) һәм пролин дегидрогеназа (ProDH1 һәм ProDH2) геннары, элек Nicotiana benthamiana һәм Arabidopsis thaliana'ны хуҗа булмаган Pseudomonas syringae штаммнарыннан саклауда катнашуы турында хәбәр ителгән иде (Senthil-Kumar һәм Mysore, 2012). Икенче яктан, гөмбә орнитин декарбоксилазасы (ODC) патоген үсеше өчен кирәк (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici'ның ODC'сын хуҗа тарафыннан индукцияләнгән генны тындыру (HIGS) аша максат итеп кую помидор үсемлекләренең Fusarium солуга каршы торучанлыгын сизелерлек арттырды (Singh et al., 2020). Ләкин, экзоген орнитин куллануның фитопатогеннар кебек биотик стрессларга каршы потенциаль роле яхшы өйрәнелмәгән. Иң мөһиме, орнитинның авыруларга каршы торучанлыкка һәм аңа бәйле биохимик һәм физиологик күренешләргә йогынтысы әлегә кадәр тулысынча өйрәнелмәгән.
Кузаклы үсемлекләрнең S. sclerotiorum инфекциясенең катлаулылыгын аңлау нәтиҗәле контроль стратегияләрен эшләү өчен мөһим. Бу тикшеренүдә без диамин L-орнитинның Sclerotinia sclerotiorum инфекциясенә каршы торучанлыгын һәм оборона механизмнарын көчәйтүдә төп фактор буларак потенциаль ролен ачыкларга омтылдык. Без, зарарланган үсемлекләрнең оборона реакцияләрен көчәйтүдән тыш, L-орнитин шулай ук ​​оксидлашу-калыбына китерү статусын саклап калуда да төп роль уйный дип фаразлыйбыз. Без L-орнитинның потенциаль йогынтысы ферментатив һәм ферментатив булмаган антиоксидант оборона механизмнарын көйләү һәм гөмбә патогенлыгы/вирулентлык факторларына һәм бәйле аксымнарга комачаулау белән бәйле дип фаразлыйбыз. L-орнитинның бу икеләтә функциональлеге аны ак гөмбә йогынтысын киметү һәм гадәти кузаклы культураларның бу көчле гөмбә патогенына каршы торучанлыгын арттыру өчен тотрыклы стратегия өчен өметле кандидат итә. Әлеге тикшеренү нәтиҗәләре ак гөмбәне контрольдә тоту һәм аның кузаклы культуралар җитештерүгә йогынтысын киметү өчен инновацион, экологик яктан чиста ысуллар эшләүдә ярдәм итә ала.
Бу тикшеренүдә, тәҗрибә материалы буларак, гадәти борчакның сизгер коммерция төре, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) кулланылды. Мисырның Авыл хуҗалыгы тикшеренүләре үзәге (ARC), Кыр культуралары тикшеренү институты (FCRI), Кузаклы культуралар тикшеренүләре бүлеге тарафыннан сәламәт орлыклар бирелде. Биш орлык пластик чүлмәкләргә (эчке диаметры 35 см, тирәнлеге 50 см) S. sclerotiorum белән зарарланган туфрак белән тутырылган, теплица шартларында (25 ± 2 °C, чагыштырма дымлылык 75 ± 1%, 8 сәгать яктылык/16 сәгать караңгы) чәчелде. Чәчүдән соң 7–10 көн үткәч (DPS), үсентеләр сирәкләнде, һәр чүлмәктә тигез үскән ике үсенте һәм өч тулысынча үскән яфрак кына калды. Чүлмәктәге барлык үсемлекләргә ике атнага бер тапкыр су сибелде һәм ай саен әлеге төр өчен тәкъдим ителгән норма буенча ашламалар сиптерелде.
500 мг/л концентрацияле L-орнитиндиамин (шулай ук ​​(+)-(S)-2,5-диаминопентан кислотасы буларак та билгеле; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) әзерләү өчен, башта 50 мг 100 мл стериль дистилляцияләнгән суда эретелде. Аннары төп эремә суюлтылды һәм аннан соңгы тәҗрибәләрдә кулланылды. Кыскасы, L-орнитин концентрацияләренең алты сериясе (12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л) in vitro тикшерелде. Моннан тыш, стериль дистилляцияләнгән су тискәре контроль (Mock) буларак кулланылды, ә коммерция фунгициды "Rizolex-T" 50% лы чылатыла торган порошок (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Гарбия губернаторлыгы, Мисыр) уңай контроль буларак кулланылды. Коммерция максатларында кулланыла торган “Rizolex-T” фунгициды in vitro шартларында биш концентрациядә (2, 4, 6, 8 һәм 10 мг/л) сыналды.
Ак гөмбәчекнең типик симптомнарын күрсәтүче гадәти фасоль сабаклары һәм кабыклары үрнәкләре (йоклау дәрәҗәсе: 10–30%) коммерция фермаларыннан җыелды. Йоктырган үсемлек материалларының күбесе төр/төр буенча билгеләнсә дә (Giza 3 коммерция сортына сизгер), башкалары, бигрәк тә җирле базарлардан алынганнары, билгесез төрләрдән иде. Җыелган йоктырган материаллар башта 0,5% натрий гипохлориты эремәсе белән 3 минут дәвамында өслек белән дезинфекцияләнде, аннары берничә тапкыр стериль дистилляцияләнгән су белән чайкалды һәм артык суны бетерү өчен стериль фильтр кәгазе белән сөртелде. Йоктырган органнар аннары урта тукымалардан (сәламәт һәм йоктырган тукымалардан) кечкенә кисәкләргә киселде, бәрәңге декстроза агарында (PDA) үстерелде һәм склеротия барлыкка килүен стимуллаштыру өчен 25 ± 2 °C температурада 12 сәгать яктылык/12 сәгать караңгы цикл белән 5 көн инкубацияләнде. Мицелиаль оч ысулы шулай ук ​​гөмбәчек изолятларын катнаш яки пычранган культуралардан чистарту өчен дә кулланылды. Чистартылган гөмбә изолятлары башта аның культураль морфологик үзенчәлекләре нигезендә билгеләнде, аннары микроскопик үзенчәлекләр нигезендә S. sclerotiorum булуы расланды. Ниһаять, барлык чистартылган изолятлар да Кох постулатларына туры килү өчен Giza 3 сизгер гади борчак сортында патогенлыкка тикшерелде.
Моннан тыш, иң инвазив S. sclerotiorum изоляты (3 нче изолят) White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 тарафыннан тасвирланганча, эчке транскрипцияләнгән спейсер (ITS) секвенирлавына нигезләнеп расланды. Кыскасы, изолятлар бәрәңге декстроза шулпасында (PDB) үстерелде һәм 25 ± 2 °C температурада 5-7 көн инкубацияләнде. Аннары гөмбә мицелийы җыелды, марля аша фильтрланды, ике тапкыр стериль су белән юылды һәм стериль фильтр кәгазе белән киптерелде. Геном ДНКсы Quick-DNA™ гөмбә/бактериаль минипрепер комплекты (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) ярдәмендә аерылды. Аннары ITS рДНК өлкәсе ITS1/ITS4 махсус праймер пары (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; көтелгән зурлык: 540 bp) ярдәмендә көчәйтелде (Baturo-Ciesniewska һ.б., 2017). Чистартылган ПЦР продуктлары секвенирлауга тапшырылды (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS рДНК эзлеклелекләре Sanger секвенирлау ысулы ярдәмендә ике яклы секвенирланды. Аннары җыелган сорау эзлеклелекләре BLASTn программасы ярдәмендә GenBank һәм Милли Биотехнология Мәгълүматы Үзәгендәге (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) соңгы мәгълүматлар белән чагыштырылды. Сорау эзлеклелеге NCBI GenBank'тагы соңгы мәгълүматлардан алынган башка 20 S. sclerotiorum штаммы/изоляты белән чагыштырылды (Өстәмә таблица S1), ClustalW ярдәмендә Молекуляр эволюцион генетика анализы пакетында (MEGA-11; 11 версия) (Kumar et al., 2024). Эволюцион анализ максималь ихтималлык ысулы һәм гомуми вакыт буенча кире кайтарыла торган нуклеотид алмаштыру моделе ярдәмендә башкарылды (Nei and Kumar, 2000). Иң югары логарифм ихтималы булган агач күрсәтелгән. Эвристик эзләү өчен башлангыч агач күрше кушылучы (NJ) агачы (Kumar et al., 2024) һәм максималь парсимония (MP) агачы арасында югарырак логарифм ихтималы булган агачны сайлап сайлана. NJ агачы гомуми вакыт буенча кире кайтарыла торган модель ярдәмендә исәпләнгән парлы ераклык матрицасы ярдәмендә төзелгән (Nei and Kumar, 2000).
L-орнитин һәм "Rizolex-T" бактерицидының антибактериаль активлыгы in vitro шартларында агар диффузиясе ысулы белән билгеләнде. Метод: L-орнитинның кирәкле күләмен (500 мг/л) алыгыз һәм аны 10 мл PDA туклыклы мохите белән яхшылап болгатыгыз, тиешенчә 12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л концентрацияле эретмәләр әзерләгез. Контроль буларак биш концентрацияле "Rizolex-T" фунгициды (2, 4, 6, 8 һәм 10 мг/л) һәм стериль дистилляцияләнгән су кулланылды. Мохит катып беткәч, яңа әзерләнгән Sclerotinia sclerotiorum культурасының мицелиаль тыгыны, диаметры 4 мм, Петри савытының үзәгенә күчерелде һәм 25±2°C температурада мицелий контроль Петри савытын тулысынча каплаганчы үстерелде, аннан соң гөмбә үсеше теркәлде. 1 нче тигезләмә ярдәмендә S. sclerotiorum радиаль үсешенең тоткарлану процентын исәпләгез:
Эксперимент ике тапкыр кабатланды, һәр контроль/эксперимент төркеме өчен алты биологик кабатлау һәм һәр биологик кабатлау өчен биш чүлмәк (һәр чүлмәктә ике үсемлек) белән. Эксперимент нәтиҗәләренең төгәллеген, ышанычлылыгын һәм кабатланучанлыгын тәэмин итү өчен һәр биологик кабатлау ике тапкыр анализланды (ике техник кабатлау). Моннан тыш, пробит регрессия анализы ярыммаксималь ингибитор концентрациясен (IC50) һәм IC99ны исәпләү өчен кулланылды (Prentice, 1976).
Парник шартларында L-орнитинның потенциалын бәяләү өчен, бер-бер артлы ике чүлмәк эксперименты үткәрелде. Кыскасы, чүлмәкләр стерильләштерелгән балчык-комлы туфрак белән тутырылды (3:1) һәм яңа әзерләнгән S. sclerotiorum культурасы белән инокуляцияләнде. Башта S. sclerotiorumның иң инвазив изоляты (3 нче изолят) бер склеротиумны икегә бүлеп, аны PDAга йөзе белән аска каратып куеп һәм мицелиаль үсешне стимуллаштыру өчен 25°C температурада даими караңгылыкта (24 сәгать) 4 көн инкубацияләп үстерелде. Аннары алгы кырыеннан дүрт 5 мм диаметрлы агар тыгыны алынды һәм 100 г бодай һәм дөге кәбеге стериль катнашмасы белән инокуляцияләнде (1:1, v/v) һәм барлык колбалар да 25 ± 2°C температурада 12 сәгать яктылык/12 сәгать караңгы цикл астында 5 көн инкубацияләнде, склеротия барлыкка килүен стимуллаштыру өчен. Туфрак өстәр алдыннан бер төрлелекне тәэмин итү өчен барлык колбаларның эчтәлеге яхшылап болгатылды. Аннары, патогеннарның даими концентрациясен тәэмин итү өчен, һәр чүлмәккә 100 г колонизацияләүче кәбек катнашмасы өстәлде. Гөмбә үсешен активлаштыру өчен инокуляцияләнгән чүлмәкләргә су сиптерелде һәм 7 көнгә теплица шартларында урнаштырылды.
Аннары һәр чүлмәккә Giza 3 сортыннан биш орлык чәчелде. L-орнитин һәм Rizolex-T фунгициды белән эшкәртелгән чүлмәкләр өчен стерильләштерелгән орлыклар башта ике кушылманың сулы эремәсендә ике сәгатькә чылатылды, аның соңгы концентрациясе якынча 250 мг/л һәм 50 мг/л иде, аннары чәчү алдыннан бер сәгать һавада киптерелде. Икенче яктан, орлыклар тискәре контроль буларак стериль дистилляцияләнгән суда чылатылды. 10 көннән соң, беренче сугару алдыннан, үсентеләр сирәкләнде, һәр чүлмәктә ике генә чиста үсенте калды. Моннан тыш, S. sclerotiorum белән зарарлануны тәэмин итү өчен, бер үк үсеш стадиясендәге (10 көн) борчак үсемлеге сабаклары стерильләштерелгән скальпель ярдәмендә ике төрле урында киселде һәм һәр ярага якынча 0,5 г колонизацияләүче кәбек катнашмасы салынды, аннары барлык инокуляцияләнгән үсемлекләрдә инфекцияне һәм авырулар үсешен стимуллаштыру өчен югары дымлылык кулланылды. Контроль үсемлекләр дә шулай ук ​​яраланган һәм ярага тигез күләмдә (0,5 г) стериль, колонизацияләнмәгән кәбек катнашмасы салынган һәм югары дымлылыкта сакланган, бу авыру үсеше өчен мохитне симуляцияләү һәм дәвалау төркемнәре арасында эзлеклелекне тәэмин итү өчен эшләнелгән.
Дәвалау ысулы: Борчак үсентеләренә туфракны сугарып, 500 мл L-орнитин (250 мг/л) сулы эремәсе яки Rizolex-T фунгициды (50 мг/л) белән су сибелде, аннары эшкәртү 10 көн аралыгы белән өч тапкыр кабатланды. Плацебо белән эшкәртелгән контроль төрләр 500 мл стериль дистилляцияләнгән су белән сугарылды. Барлык эшкәртүләр дә теплица шартларында (25 ± 2°C, 75 ± 1% чагыштырма дымлылык һәм 8 сәгать яктылык/16 сәгать караңгы фотопериод) үткәрелде. Барлык чүлмәкләргә дә ике атна саен су сибелде һәм ай саен баланслы NPK ашламасы (20-20-20, 3,6% күкерт һәм TE микроэлементлары белән; Zain Seeds, Мисыр) белән 3-4 г/л концентрациясендә, билгеле бер төр өчен тәкъдимнәргә һәм җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, яфраклар белән сиптерү юлы белән эшкәртелде. Башкача күрсәтелмәгән очракта, тулысынча киңәйтелгән өлгергән яфраклар (өстән 2 нче һәм 3 нче яфраклар) һәр биологик кабатлаудан эшкәртүдән соң 72 сәгать узгач (hpt) җыелды, гомогенлаштырылды, берләштерелде һәм -80 °C температурада сакланды, шул исәптән, ләкин моның белән чикләнмичә, оксидатив стресс индикаторларының гистохимик локализациясен, липид пероксидациясен, ферментатив һәм ферментатив булмаган антиоксидантларны һәм ген экспрессиясен тикшерү өчен.
Ак гөмбә инфекциясенең интенсивлыгы инокуляциядән соң 21 көн дәвамында атна саен 1–9 шкаласы (Өстәмә S2 таблицасы) ярдәмендә бәяләнде, ул Теран һ.б. (2006) тарафыннан үзгәртелгән Петцольдт һәм Диксон шкаласы (1996) нигезендә эшләнде. Кыскасы, борчак үсемлекләренең сабаклары һәм ботаклары инокуляция ноктасыннан башлап, төеннәр һәм төеннәр буйлап җәрәхәтләрнең үсешен күзәтеп барылды. Аннары җәрәхәтнең инокуляция ноктасыннан сабак яки ботак буйлап иң ерак ноктага кадәр арасы үлчәнде һәм җәрәхәтнең урнашуына нигезләнеп 1–9 балл куелды, анда (1) инокуляция ноктасы янында күренмәле инфекция юклыгын һәм (2–9) җәрәхәтнең зурлыгының һәм төеннәр/төеннәр буйлап үсешенең әкренләп артуын күрсәтте (Өстәмә S2 таблицасы). Аннары ак гөмбә инфекциясенең интенсивлыгы 2 нче формула ярдәмендә процентларга әйләндерелде:
Моннан тыш, авыруның үсеш сызыгы астындагы мәйдан (AUDPC) формула (Shaner and Finney, 1977) ярдәмендә исәпләнде, ул күптән түгел гади борчакның ак череге өчен җайлаштырылган иде (Chauhan et al., 2020), 3 нче тигезләмә ярдәмендә:
Монда Yi = ti вакытындагы авыруның авырлыгы, Yi+1 = киләсе вакыттагы авыруның авырлыгы ti+1, ti = беренче үлчәү вакыты (көннәрдә), ti+1 = киләсе үлчәү вакыты (көннәрдә), n = вакыт нокталарының яки ​​күзәтү нокталарының гомуми саны. Үсемлек биеклеге (см), үсемлектәге ботаклар саны һәм үсемлектәге яфраклар санын үз эченә алган фасоль үсемлеге үсеш параметрлары барлык биологик кабатлауларда 21 көн дәвамында атна саен теркәлде.
Һәр биологик кабатлауда яфрак үрнәкләре (өстән икенче һәм өченче тулысынча үскән яфраклар) эшкәртүдән соң 45 нче көнне (соңгы эшкәртүдән соң 15 көн узгач) җыелды. Һәр биологик кабатлау биш чүлмәктән торды (һәр чүлмәктә ике үсемлек). Вакланган тукымадан якынча 500 мг караңгыда 4°C температурада 80% ацетон кулланып фотосинтетик пигментларны (хлорофилл а, хлорофилл b һәм каротиноидлар) экстракцияләү өчен кулланылды. 24 сәгатьтән соң үрнәкләр центрифугаланды һәм өслек катлам җыелды, хлорофилл а, хлорофилл b һәм каротиноидлар эчтәлеген UV-160A спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярдәмендә колориметрик рәвештә билгеләү өчен өч төрле дулкын озынлыгында (A470, A646 һәм A663 нм) абсорбцияне үлчәү юлы белән (Lichtenthaler, 1987) методы буенча. Ниһаять, фотосинтетик пигментларның эчтәлеге Lichtenthaler (1987) тарафыннан тасвирланган түбәндәге 4–6 формулалар ярдәмендә исәпләнде.
Эшкәртүдән соң 72 сәгать узгач (hpt), водород пероксидының (H2O2) һәм супероксид анионының (O2•−) in situ гистохимик локализациясен тикшерү өчен һәр биологик репликадан яфраклар (өстән икенче һәм өченче тулысынча үскән яфраклар) җыелды. Һәр биологик реплика биш чүлмәктән торды (һәр чүлмәктә ике үсемлек). Методның төгәллеген, ышанычлылыгын һәм кабатланучанлыгын тәэмин итү өчен һәр биологик реплика икеләтә анализланды (ике техник реплика). H2O2 һәм O2•−, Ромеро-Пуэртас һ.б. (2004) һәм Адам һ.б. (1989) тарафыннан тасвирланган ысулларга ияреп, кечкенә үзгәрешләр белән 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) яки нитрозәңгәр тетразолий (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) кулланып билгеләнде. H2O2 гистохимик локализациясен урнаштыру өчен, яфраклар 10 мМ Tris буферында (рН 7.8) 0.1% DAB белән вакуумда инфильтрацияләнде һәм аннары бүлмә температурасында яктылыкта 60 минут инкубацияләнде. Яфраклар 4:1 (к/к) этанол:хлороформда (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каһирә, Мисыр) 0.15% (к/к) TCAда агартылды һәм караңгыланганчы яктылыкка куелды. Шулай ук, клапаннарга O2•− гистохимик локализациясен урнаштыру өчен 0.1 w/v % HBT булган 10 мМ калий фосфаты буферы (рН 7.8) белән вакуумда инфильтрацияләнде. Яфраклар бүлмә температурасында яктылыкта 20 минут инкубацияләнде, аннары югарыдагыча агартылды һәм аннары куе зәңгәр/шәмәхә таплар барлыкка килгәнче яктыртылды. Нәтиҗәдә барлыкка килгән көрән (H2O2 индикаторы буларак) яки зәңгәр-шәмәхә (O2•− индикаторы буларак) төснең интенсивлыгы ImageJ рәсем эшкәртү пакетының Фиджи версиясе ярдәмендә бәяләнде (http://fiji.sc; 2024 елның 7 мартында керү мөмкинлеге).
Малондальдегид (MDA; липид пероксидациясе маркеры буларак) Du һәм Bramlage (1992) методы буенча кечкенә үзгәрешләр белән билгеләнде. Һәр биологик репликациядән (өстән икенче һәм өченче тулысынча үскән яфраклар) яфраклар эшкәртүдән соң 72 сәгатьтән соң (hpt) җыелды. Һәр биологик репликация биш чүлмәктән (һәр чүлмәктә ике үсемлек) торды. Методның төгәллеген, ышанычлылыгын һәм кабатланучанлыгын тәэмин итү өчен һәр биологик реплика икеләтә анализланды (ике техник реплика). Кыскасы, MDA экстракциясе өчен 0,5 г вакланган яфрак тукымасы 0,01% бутилланган гидрокситолуол (BHT; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) булган 20% трихлорацетат кислотасы (TCA; MilliporeSigma, Берлингтон, MA, АКШ) белән кулланылды. Аннары өслек катламындагы MDA күләме UV-160A спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярдәмендә 532 һәм 600 нм да абсорбцияне үлчәп, колориметрик рәвештә билгеләнде һәм аннары нмоль g−1 FW рәвешендә күрсәтелде.
Ферментатив булмаган һәм ферментатив антиоксидантларны бәяләү өчен, эшкәртүдән соң 72 сәгать узгач (hpt) һәр биологик кабатлаудан яфраклар (өстән икенче һәм өченче тулысынча үскән яфраклар) җыелды. Һәр биологик кабатлау биш чүлмәктән торды (һәр чүлмәктә ике үсемлек). Һәр биологик үрнәк икеләтә анализланды (ике техник үрнәк). Ике яфрак сыек азот белән тартылды һәм ферментатив һәм ферментатив булмаган антиоксидантларны, гомуми аминокислоталарны, пролин күләмен, ген экспрессиясен һәм оксалат күләмен билгеләү өчен турыдан-туры кулланылды.
Барлык эри торган феноллар Фолин-Чиокалтеу реактивы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) ярдәмендә Кахконен һ.б. (1999) тарафыннан тасвирланган ысулга бераз үзгәрешләр кертеп билгеләнде. Кыскасы, якынча 0,1 г гомогенлаштырылган яфрак тукымасы 20 мл 80% метанол белән караңгыда 24 сәгать дәвамында экстракцияләнде һәм өслек катламы центрифугалаудан соң җыелды. Үрнәк экстрактының 0,1 мл 0,5 мл Фолин-Чиокалтеу реактивы (10%) белән кушылды, 30 секунд селкетелде һәм 5 минут караңгыда калдырылды. Аннары һәр пробиркага 0,5 мл 20% натрий карбонаты эремәсе (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каһирә, Мисыр) өстәлде, яхшылап болгатылды һәм бүлмә температурасында караңгыда 1 сәгать инкубацияләнде. Инкубациядән соң, реакция катнашмасының абсорбциясе 765 нм диапазонда UV-160A спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярдәмендә үлчәнде. Үрнәк экстрактларындагы гомуми эри торган фенолларның концентрациясе галл кислотасын калибрлау кәкресе (Fisher Scientific, Hampton, NH, АКШ) ярдәмендә билгеләнде һәм яңа авырлыкның бер граммына галл кислотасы эквивалентының миллиграммы рәвешендә күрсәтелде (мг GAE g-1 яңа авырлык).
Эри торган флавоноидларның гомуми күләме Джеридан һ.б. (2006) методы буенча, бераз үзгәрешләр белән билгеләнде. Кыскасы, югарыда күрсәтелгән метанол экстрактының 0,3 мл 5% алюминий хлориды эремәсе (AlCl3; Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, АКШ) белән кушылды, нык болгатты һәм аннары бүлмә температурасында 5 минут инкубацияләнде, аннары 0,3 мл 10% калий ацетаты эремәсе (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Мисыр) өстәлде, яхшылап болгатты һәм бүлмә температурасында 30 минут караңгыда инкубацияләнде. Инкубациядән соң, реакция катнашмасының абсорбциясе 430 нм да UV-160A спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярдәмендә үлчәнде. Үрнәк экстрактларындагы гомуми эри торган флавоноидларның концентрациясе рутин калибрлау кәкресе (TCI America, Портленд, Орегон, АКШ) ярдәмендә билгеләнде, аннары яңа авырлыкның бер граммына рутин эквивалентының миллиграммы буларак күрсәтелде (мг RE г-1 яңа авырлык).
Борчак яфракларының гомуми ирекле аминокислота күләме Йокояма һәм Хираматсу (2003) тәкъдим иткән һәм Сан һ.б. (2006) тарафыннан модификацияләнгән ысулга нигезләнгән модификацияләнгән нингидрин реактивы (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, АКШ) ярдәмендә билгеләнде. Кыскасы, 0,1 г туфрак тукымасының pH 5,4 буферы белән экстракцияләнде, һәм 200 мкл өслек катламы 200 мкл нингидрин (2%) һәм 200 мкл пиридин (10%; Spectrum Chemical, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, АКШ) белән реакциягә кертелде, кайнап торган су мунчасында 30 минут инкубацияләнде, аннары суытылды һәм UV-160A спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярдәмендә 580 нм да үлчәнде. Икенче яктан, пролин Бейтс ысулы белән билгеләнде (Bates һ.б., 1973). Пролин 3% сульфосалицил кислотасы белән экстракцияләнде (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, АКШ) һәм центрифугалаудан соң, 0,5 мл өслек катламы 1 мл бозлы сиркә кислотасы (Fisher Scientific, Hampton, NH, АКШ) һәм нингидрин реагенты белән кушылды, 90°C температурада 45 минут инкубацияләнде, суытылды һәм югарыдагы кебек үк спектрофотометр ярдәмендә 520 нм толкын озынлыгында үлчәнде. Яфрак экстрактларындагы гомуми ирекле аминокислоталар һәм пролин глицин һәм пролин калибрлау кәкреләре (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, АКШ) ярдәмендә билгеләнде һәм мг/г яңа авырлыкта күрсәтелде.
Антиоксидант ферментларның ферментатив активлыгын билгеләү өчен, якынча 500 мг гомогенлаштырылган тукыма 1 мМ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) һәм 7,5% поливинилпирролидон (PVP; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) булган 3 мл 50 мМ Tris буферы (рН 7,8) белән экстракцияләнде, суыткычта (4 °C) 20 минут дәвамында 10,000 × g тизлектә центрифугаланды һәм өслек катламы (чимал фермент экстракты) җыелды (El-Nagar һ.б., 2023; Osman һ.б., 2023). Каталаза (CAT) аннары 2 мл 0,1 М натрий фосфаты буферы (рН 6,5; Сигма-Алдрич, Сент-Луис, Миссури, АКШ) һәм 100 мкл 269 мМ H2O2 эремәсе белән реакциягә кертелде, аның ферментатив активлыгын билгеләү өчен, Aebi (1984) методы буенча, бераз үзгәрешләр белән (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) кулланылды. Гуайакольгә бәйле пероксидаза (POX) ферментатив активлыгы Харрах et al. (2009) методы ярдәмендә билгеләнде. (2008) кечкенә үзгәрешләр белән (El-Nagar һ.б., 2023; Osman һ.б., 2023) һәм полифенол оксидазасының (PPO) ферментатив активлыгы 2,2 мл 100 мМ натрий фосфаты буферы (рН 6,0), 100 мкл гваяколь (TCI chemicals, Портленд, Орегон, АКШ) һәм 100 мкл 12 мМ H2O2 белән реакциядән соң билгеләнде. Метод (El-Nagar һ.б., 2023; Osman һ.б., 2023) кулланылганнан бераз үзгәртелде. Анализ 0,1 М фосфат буферында (рН 6,0) яңа әзерләнгән 3 мл катехол эремәсе (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, АКШ) (0,01 М) белән реакциядән соң башкарылды. CAT активлыгы 240 нм (A240) да H2O2 таркалуын күзәтеп үлчәнде, POX активлыгы 436 нм (A436) да абсорбция артуын күзәтеп үлчәнде, ә PPO активлыгы UV-160A спектрофотометры (Шимадзу, Япония) ярдәмендә 495 нм (A495) да 3 минут саен абсорбция тирбәнешләрен теркәп үлчәнде.
Соңгы эшкәртүдән соң 72 сәгать узгач, борчак яфракларында (өстән икенче һәм өченче тулысынча үскән яфраклар) пероксисомаль каталаза (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), супероксиддисмутаза (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) һәм глутатион редуктаза (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) кебек өч антиоксидант белән бәйле генның транскрипт дәрәҗәләрен ачыклау өчен реаль вакыт режимындагы RT-ПЦР кулланылды. Кыскасы, РНК җитештерүче протоколы буенча Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Кытай) ярдәмендә аерылды. Аннары, җитештерүче күрсәтмәләре буенча TOP script™ cDNA Synthesis Kit кулланып, кДНК синтезланды. Югарыдагы өч генның праймер эзлеклелеге S3 өстәмә таблицасында күрсәтелгән. PvActin-3 (GenBank керү номеры: XM_068616709.1) йорт хуҗалыгы гены буларак кулланылды һәм чагыштырма ген экспрессиясе 2-ΔΔCT ысулы ярдәмендә исәпләнде (Livak һәм Schmittgen, 2001). Биотик стресс (гади кузаклылар һәм антракноз гөмбәсе Colletotrichum lindemuthianum арасында туры килмәгән үзара бәйләнеш) һәм абиотик стресс (корылык, тозлылык, түбән температура) шартларында актин тотрыклылыгы күрсәтелде (Borges һ.б., 2012).
Башта без S. sclerotiorum'дагы оксалоацетат ацетилгидролаза (OAH) аксымнарының геном күләмендә кремний анализын протеин-протеин BLAST коралы (BLASTp 2.15.0+) ярдәмендә үткәрдек (Altschul һ.б., 1997, 2005). Кыскасы, без S. sclerotiorum'дагы гомологик аксымны картага төшерү өчен сорау эзлеклелеге буларак Aspergillus fijiensis CBS 313.89'дан (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank керү номеры XP_040799428.1; 342 аминокислота) һәм Penicillium lagena'дан (PlOAH; таксид: 94218; GenBank керү номеры XP_056833920.1; 316 аминокислота) OAH кулландык (таксид: 5180). BLASTp биотехнология мәгълүматлары буенча милли үзәк (NCBI) сайтындагы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) GenBank'тагы иң соңгы S. sclerotiorum геномы мәгълүматларына каршы башкарылды.
Моннан тыш, S. sclerotiorum'нан фаразланган OAH гены (SsOAH) һәм A. fijiensis CBS 313.89'дан AfOAH һәм P. lagena'дан PlOAH эволюцион анализы һәм филогенетик агачы MEGA11'дә максималь ихтималлык ысулы (Tamura et al., 2021) һәм JTT матрица нигезендәге модель (Jones et al., 1992) ярдәмендә чыгарылды. Филогенетик агач S. sclerotiorum'нан фаразланган барлык OAH геннарының (SsOAH) аксым эзлеклелекләренең күпсанлы тигезләү анализы һәм чикләүләргә нигезләнгән тигезләү коралы (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) кулланып сорау эзлеклелеге белән берләштерелде (Papadopoulos һәм Agarwala, 2007). Моннан тыш, S. sclerotiorum'нан алынган SsOAH'ның иң яхшы туры килә торган аминокислоталар эзлеклелеге ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ярдәмендә сорау эзлеклелекләре (AfOAH һәм PlOAH) белән тигезләнде (Larkin һ.б., 2007), һәм тигезләүдәге сакланган өлкәләр ESPript коралы (3.0 версиясе; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ярдәмендә күрсәтелде.
Моннан тыш, фаразланган функциональ репрезентатив доменнар һәм сакланган S. sclerotiorum SsOAH сайтлары InterPro коралы (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ярдәмендә төрле гаиләләргә интерактив рәвештә классификацияләнде (Blum һ.б., 2021). Ниһаять, фаразланган S. sclerotiorum SsOAH-ның өч үлчәмле (3D) структура модельләштерүе Аксым Гомологиясе/Аналогия Тану Двигателе (Phyre2 сервер версиясе 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley һ.б., 2015) ярдәмендә башкарылды һәм SWISS-MODEL серверы (https://swissmodel.expasy.org/) ярдәмендә тикшерелде (Biasini һ.б., 2014). Фаразланган өч үлчәмле структуралар (PDB форматы) UCSF-Chimera пакеты (1.15 версиясе; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) ярдәмендә интерактив рәвештә визуализацияләнде (Петтерсен һ.б., 2004).
Sclerotinia sclerotiorum мицелийларында оксалоацетат ацетилгидролазаның (SsOAH; GenBank керү номеры: XM_001590428.1) транскрипция дәрәҗәсен билгеләү өчен санлы реаль вакытлы флуоресценция ПЦР кулланылды. Кыскасы, S. sclerotiorum PDB булган колбага салынды һәм мицелия үсешен стимуллаштыру өчен 25 ± 2 °C температурада 24 сәгать дәвамында 150 әйләнү/мин тизлегендә һәм даими караңгылыкта (24 сәгать) селкетүче инкубаторга урнаштырылды (модель: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA). Шуннан соң, күзәнәкләр L-орнитин һәм Rizolex-T фунгициды белән соңгы IC50 концентрацияләрендә (якынча 40 һәм 3,2 мг/л) эшкәртелде, аннары шул ук шартларда тагын 24 сәгать үстерелде. Инкубациядән соң, культуралар 2500 әйләнү/мин тизлегендә 5 минут дәвамында центрифугаланды һәм өслек катламы (гөмбә мицелийы) ген экспрессиясен анализлау өчен җыелды. Шулай ук, гөмбә мицелийы инфекцияләнгән тукымаларның өслегендә ак гөмбә һәм мамыксыман мицелий барлыкка китергән зарарланган үсемлекләрдән инфекциядән соң 0, 24, 48, 72, 96 һәм 120 сәгатьтә җыелды. Гөмбә мицелийыннан РНК алынды, аннары кДНК югарыда тасвирланганча синтезланды. SsOAH өчен праймер эзлеклелеге S3 өстәмә таблицасында күрсәтелгән. SsActin (GenBank керү номеры: XM_001589919.1) йорт хуҗалыгы гены буларак кулланылды, һәм чагыштырма ген экспрессиясе 2-ΔΔCT ысулы белән исәпләнде (Livak һәм Schmittgen, 2001).
Оксалат кислотасы бәрәңге декстрозасы шулпасында (PDB) һәм Sclerotinia sclerotiorum гөмбәчек патогены булган үсемлек үрнәкләрендә Xu һәм Zhang (2000) методы буенча кечкенә үзгәрешләр белән билгеләнде. Кыскасы, S. sclerotiorum изолятлары PDB булган колбаларга салынды, аннары мицелиаль үсешне стимуллаштыру өчен даими караңгылыкта (24 сәгать) 3-5 көн дәвамында 25 ± 2 °C температурада 150 әйләнеш/мин тизлектә селкетүче инкубаторда (I2400 моделе, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) үстерелде. Инкубациядән соң, гөмбәчек культурасы башта Whatman #1 фильтр кәгазе аша фильтрланды, аннары калдык мицелийны бетерү өчен 2500 әйләнеш/мин тизлектә 5 минут дәвамында центрифугаланды. Өслек катламы җыелды һәм оксалатны тагын да күбрәк санлы билгеләү өчен 4°C температурада сакланды. Үсемлек үрнәкләрен әзерләү өчен якынча 0,1 г үсемлек тукымалары кисәкләре дистилляцияләнгән су белән өч тапкыр (һәр тапкыр 2 мл) чыгарылды. Аннары үрнәкләр 2500 әйләнү/мин тизлегендә 5 минут дәвамында центрифугаланган, өслек матдәсе Whatman № 1 фильтр кәгазе аша коры фильтрланган һәм алга таба анализ өчен җыелган.
Оксалат кислотасының санлы анализы өчен, реакция катнашмасы пыяла тыгынлы пробиркада түбәндәге тәртиптә әзерләнде: 0,2 мл үрнәк (яки PDB культурасы фильтраты яки оксалат кислотасы стандарт эремәсе), 0,11 мл бромфенол зәңгәре (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Питтсбург, Пенсильвания, АКШ), 0,198 мл 1 М күкерт кислотасы (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каһирә, Мисыр) һәм 0,176 мл 100 мМ калий дихроматы (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портленд, Орегон, АКШ), аннары эремә дистилляцияләнгән су белән 4,8 мл га кадәр сыекландырылды, ныклы кушылды һәм шунда ук 60 °C су мунчасына куелды. 10 минуттан соң реакция 0,5 мл натрий гидроксиды эремәсе (NaOH; 0,75 М) өстәп туктатылды. Реакция катнашмасының абсорбциясе (A600) 600 нм да UV-160 спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярдәмендә үлчәнде. Культура фильтратларын һәм үсемлек үрнәкләрен санлаштыру өчен контроль буларак PDB һәм дистилляцияләнгән су кулланылды. Культура фильтратларындагы оксалат кислотасы концентрацияләре, PDB мохитенең миллилитрына оксалат кислотасының микрограммнары (μg.mL−1) һәм яфрак экстрактларындагы, яңа авырлыкның бер граммына оксалат кислотасының микрограммнары (μg.g−1 FW) буларак, оксалат кислотасын калибрлау кәкресе ярдәмендә билгеләнде (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, АКШ).
Тикшеренү барышында барлык экспериментлар да тулысынча очраклы дизайнда (CRD) эшләнгән, башкача күрсәтелмәгән очракта, һәр эшкәртүгә алты биологик кабатлау һәм һәр биологик кабатлауга биш чүлмәк (һәр чүлмәккә ике үсемлек) кертелгән. Биологик кабатлаулар икеләтә анализланган (ике техник кабатлау). Шул ук экспериментның кабатланучанлыгын тикшерү өчен техник кабатлаулар кулланылган, ләкин ялган кабатлаулардан качу өчен статистик анализда кулланылмаган. Мәгълүматлар статистика ягыннан дисперсия анализы (ANOVA) ярдәмендә анализланган, аннан соң Туки-Крамерның чыннан да әһәмиятле аермасы (HSD) тесты (p ≤ 0,05). In vitro экспериментлары өчен IC50 һәм IC99 кыйммәтләре пробит моделе ярдәмендә исәпләнгән һәм 95% ышаныч интерваллары исәпләнгән.
Мисырның Әл-Габия губернаторлыгындагы төрле соя басуларыннан барлыгы дүрт изолят җыелган. PDA мохитендә барлык изолятлар да каймаксыман ак мицелий җитештергән, ул тиз арада мамыксыман ак төскә әйләнгән (1А рәсем), аннары склеротий стадиясендә беж яки көрән төскә кергән. Склеротийлар гадәттә тыгыз, кара, сферик яки дөрес булмаган формада, озынлыгы 5,2 - 7,7 мм һәм диаметры 3,4 - 5,3 мм (1В рәсем). Дүрт изолят 25 ± 2 °C температурада 10-12 көн инкубацияләгәннән соң культура мохите кырыенда склеротийның кырый үрнәген үстерсә дә (1А рәсем), алар арасында бер пластинадагы склеротийлар саны шактый аерылып торган (P < 0,001), 3 нче изолятта иң күп склеротийлар саны булган (бер пластинада 32,33 ± 1,53 склеротий; 1С рәсем). Шулай ук, 3 нче изолят PDBда башка изолятларга караганда күбрәк оксалат кислотасы җитештерде (3,33 ± 0,49 мкг.мл−1; 1D рәсем). 3 нче изолят фитопатоген гөмбәсе Sclerotinia sclerotiorum өчен типик морфологик һәм микроскопик үзенчәлекләрне күрсәтте. Мәсәлән, PDAда 3 нче изолят колонияләре тиз үсте, каймаксыман ак төстә (1А рәсем), кире беж яки ачык лосось сары-көрән төстә иде, һәм 9 см диаметрлы пластинаның өслеген тулысынча каплау өчен 25 ± 2°C температурада 6-7 көн кирәк булды. Югарыда күрсәтелгән морфологик һәм микроскопик үзенчәлекләргә нигезләнеп, 3 нче изолят Sclerotinia sclerotiorum буларак билгеләнде.
1 нче рәсем. Гадәти кузаклы культуралардан алынган S. sclerotiorum изолятларының үзенчәлекләре һәм патогенлыгы. (A) PDA мохитендә дүрт S. sclerotiorum изолятының мицелий үсеше, (B) дүрт S. sclerotiorum изолятының склеротиясе, (C) склеротияләр саны (бер тәлинкәдә), (D) PDB мохитендә кузгалак кислотасы бүленеше (μg.mL−1), һәм (E) Giza 3 сизгер коммерция кузаклы культурасы сортында дүрт S. sclerotiorum изолятының авыру авырлыгы (%) теплица шартларында. Кыйммәтләр биш биологик кабатлауның уртача ± SD күрсәткечен күрсәтә (n = 5). Төрле хәрефләр дәвалау арасындагы статистик яктан әһәмиятле аермаларны күрсәтә (p < 0,05). (F–H) 3 нче изолятка (dpi) инокуляция ясаганнан соң 10 көн үткәч, җир өсте сабакларында һәм силикаларда типик ак гөмбә симптомнары барлыкка килде. (I) S. sclerotiorum #3 изолятының эчке транскрипцияләнгән спейсер (ITS) өлкәсенең эволюцион анализы максималь ихтималлык ысулы ярдәмендә башкарылды һәм Милли биотехнология мәгълүмат үзәге (NCBI) мәгълүмат базасыннан (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) алынган 20 эталон изолят/штамм белән чагыштырылды (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Кластер сызыклары өстендәге саннар өлкәнең каплавын (%), ә кластер сызыклары астындагы саннар тармак озынлыгын күрсәтә.
Моннан тыш, патогенлыкны раслау өчен, алынган дүрт S. sclerotiorum изолятлары теплица шартларында сизгер коммерция борчак сорты Giza 3 ны инокуляцияләү өчен кулланылды, бу Кох постулатларына туры килә (1E рәсем). Алынган барлык гөмбә изолятлары да патоген булып, яшел борчакны зарарлый алса да (Giza 3 дип искә алыгыз), барлык җир өсте өлешләрендә (1F рәсем), бигрәк тә сабакларда (1G рәсем) һәм кабыкларда (1H рәсем) типик ак гөмбә симптомнары тудырса да, инокуляциядән соң 10 көн үткәч (dpi), 3 изоляты ике бәйсез экспериментта иң агрессив изолят булды. 3 изоляты борчак үсемлекләрендә иң югары авырлык дәрәҗәсенә (%) ия булды (инфекциядән соң 7, 14 һәм 21 көн үткәч, тиешенчә 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 һәм 76,7 ± 3,1; 1F рәсем).
Иң инвазив S. sclerotiorum изоляты #3 нең ачыклануы эчке транскрипцияләнгән спейсер (ITS) секвенирлавы нигезендә расланды (1I рәсем). 3 нче изолят һәм 20 эталон изолят/штамм арасындагы филогенетик анализ алар арасында югары охшашлык (>99%) күрсәтте. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, S. sclerotiorum изоляты #3 (533 bp) коры борчак орлыкларыннан аерылган Америка S. sclerotiorum изоляты LPM36 (GenBank керү номеры MK896659.1; 540 bp) һәм кытай S. sclerotiorum изоляты YKY211 (GenBank керү номеры OR206374.1; 548 bp) белән югары охшашлыкка ия, бу исә фиалка (Matthiola incana) сабагы черүен китереп чыгара, аларның барысы да дендрограмманың өске өлешендә аерым төркемләнгән (1I рәсем). Яңа эзлеклелек NCBI мәгълүмат базасына кертелде һәм "Sclerotinia sclerotiorum – изолят YN-25" дип аталды (GenBank керү номеры PV202792). Күренгәнчә, 3 нче изолят иң инвазив изолят; шуңа күрә бу изолят барлык аннан соңгы экспериментларда тикшеренү өчен сайланды.
Диамин L-орнитинның (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) төрле концентрацияләрдә (12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л) S. sclerotiorum изоляты 3кә каршы антибактериаль активлыгы in vitro тикшерелде. Шунысы игътибарга лаек, L-орнитин антибактериаль йогынты ясады һәм S. sclerotiorum hyphae радиаль үсешен дозага бәйле рәвештә әкренләп тоткарлады (2А, В рәсемнәр). Сыналган иң югары концентрациядә (125 мг/л) L-орнитин мицелиаль үсешнең иң югары тоткарлану тизлеген күрсәтте (99,62 ± 0,27%; 2В рәсем), бу сыналган иң югары концентрациядә (10 мг/л) Rizolex-T коммерция фунгицидына тиң иде (тоткарлану тизлеге 99,45 ± 0,39%; 2С рәсем), бу охшаш нәтиҗәлелекне күрсәтә.
2 нче рәсем. L-орнитинның Sclerotinia sclerotiorumга каршы in vitro антибактериаль активлыгы. (A) L-орнитинның төрле концентрацияләренең S. sclerotiorumга каршы антибактериаль активлыгын коммерция фунгициды Rizolex-T (10 мг/л) белән чагыштыру. (B, C) Төрле концентрациядәге L-орнитин (12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л) яки Rizolex-T (2, 4, 6, 8 һәм 10 мг/л) белән эшкәрткәннән соң S. sclerotiorum мицелиаль үсешен тоткарлау дәрәҗәсе (%). Кыйммәтләр биш биологик кабатлауның уртача ± SD күрсәткечен күрсәтә (n = 5). Төрле хәрефләр дәвалау арасындагы статистик аермаларны күрсәтә (p < 0,05). (D, E) L-орнитин һәм коммерция фунгициды Rizolex-Tның пробит моделе регрессия анализы. Пробит моделенең регрессия сызыгы зәңгәр сызык белән, ә ышаныч интервалы (95%) өзек кызыл сызык белән күрсәтелгән.
Моннан тыш, пробит регрессиясе анализы үткәрелде һәм тиешле графиклар 1 нче таблицада һәм 2D, E рәсемнәрендә күрсәтелгән. Кыскасы, кабул ителә торган авышлык кыйммәте (y = 2.92x − 4.67) һәм аңа бәйле мөһим статистика (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 һәм p < 0.0001; 2D рәсем) L-орнитинның S. sclerotiorumга каршы коммерция фунгициды Rizolex-T белән чагыштырганда (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 һәм p < 0.0001) гөмбәчекләргә каршы активлыгы артуын күрсәтте (1 нче таблица).
1 нче таблица. S. sclerotiorumга каршы L-орнитин һәм коммерция фунгициды "Rizolex-T"ның ярты максималь ингибитор концентрациясенең (IC50) һәм IC99 (мг/л) кыйммәтләре.
Гомумән алганда, L-орнитин (250 мг/л) эшкәртелгән гади борчак үсемлекләрендә ак күгәрек үсешен һәм авырлыгын, эшкәртелмәгән S. sclerotiorum белән зарарланган үсемлекләргә караганда, сизелерлек киметкән (контроль; 3А рәсем). Кыскасы, эшкәртелмәгән зарарланган контроль үсемлекләрнең авырлыгы әкренләп артса да (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 һәм 92,33 ± 3,06%), L-орнитин эксперимент дәвамында авыру авырлыгын (%) сизелерлек киметкән (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 һәм 26,36 ± 3,07), эшкәртүдән соң 7, 14 һәм 21 көннән соң (dpt) (3А рәсем). Шулай ук, S. sclerotiorum белән зарарланган фасоль үсемлекләрен 250 мг/л L-орнитин белән эшкәрткәндә, авыруның үсеш сызыгы астындагы мәйдан (AUDPC) эшкәртелмәгән контроль төркемдәге 1274,33 ± 33,13тән 281,03 ± 7,95кә кадәр кимегән, бу уңай контроль 50 мг/л Rizolex-T фунгицидыныкыннан бераз түбәнрәк (183,61 ± 7,71; 3B рәсем). Икенче экспериментта да шул ук тенденция күзәтелгән.
3 нче рәсем. L-орнитинны экзоген куллануның Sclerotinia sclerotiorum китереп чыгарган гади борчакның ак череге үсешенә йогынтысы. (A) 250 мг/л L-орнитин белән эшкәрткәннән соң гади борчакның ак гөмбәчегенең авыру үсеше кәкресе. (B) L-орнитин белән эшкәрткәннән соң гади борчакның ак гөмбәчегенең авыру үсеше кәкресе астындагы мәйдан (AUDPC). Кыйммәтләр биш биологик кабатлауның уртача ± SD күрсәткечләрен күрсәтә (n = 5). Төрле хәрефләр дәвалау арасындагы статистик яктан әһәмиятле аермаларны күрсәтә (p < 0,05).
250 мг/л L-орнитинны экзоген куллану 42 көннән соң үсемлекнең биеклеген (4А рәсем), үсемлектәге ботаклар санын (4В рәсем) һәм яфраклар санын (4С рәсем) әкренләп арттырды. Rizolex-T коммерция фунгициды (50 мг/л) өйрәнелгән барлык туклыклылык параметрларына иң зур йогынты ясаса да, 250 мг/л L-орнитинны экзоген куллану дәваламаган контроль төркем белән чагыштырганда икенче зур йогынты ясады (4А–С рәсемнәр). Икенче яктан, L-орнитин белән эшкәртү фотосинтетик пигментлар хлорофилл a (4D рәсем) һәм хлорофилл b (4E рәсем) микъдарына сизелерлек йогынты ясамады, ләкин тискәре контроль (0,44 ± 0,02 мг/г fr wt) һәм уңай контроль (0,46 ± 0,02 мг/г fr wt; 4F рәсем) белән чагыштырганда, гомуми каротиноид микъдарын (0,56 ± 0,03 мг/г fr wt) бераз арттырды. Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр L-орнитинның эшкәртелгән кузаклылар өчен фитотоксик түгеллеген һәм хәтта аларның үсешен стимуллаштырырга мөмкин булуын күрсәтә.
4 нче рәсем. Экзоген L-орнитин куллануның теплица шартларында Sclerotinia sclerotiorum белән зарарланган фасоль яфракларының үсеш үзенчәлекләренә һәм фотосинтетик пигментларына йогынтысы. (A) Үсемлек биеклеге (см), (B) Бер үсемлектәге ботаклар саны, (C) Бер үсемлектәге яфраклар саны, (D) Хлорофиллның күләме (мг г-1 fr авырлыгы), (E) Хлорофиллның күләме (мг г-1 fr авырлыгы), (F) Каротиноидларның гомуми күләме (мг г-1 fr авырлыгы). Кыйммәтләр биш биологик кабатлауның уртача ± SD күрсәткече (n = 5). Төрле хәрефләр дәвалау арасындагы статистик яктан әһәмиятле аермаларны күрсәтә (p < 0,05).
Реактив кислород төрләренең (ROS; водород пероксиды [H2O2] рәвешендә күрсәтелгән) һәм ирекле радикалларның (супероксид анионнары [O2•−] рәвешендә күрсәтелгән) гистохимик локализациясе күрсәткәнчә, L-орнитинның (250 мг/л) экзоген кулланылышы, дәваламаган зарарланган үсемлекләрнең (173,31 ± 12,06 һәм 149,35 ± 7,94 нмол.г−1 FW, тиешенчә) һәм 50 мг/л коммерция фунгициды Rizolex-T белән эшкәртелгән үсемлекләрнең (170,12 ± 9,50 һәм 157,00 ± 7,81 нмол.г−1 fr wt, тиешенчә) туплануы белән чагыштырганда, H2O2 (96,05 ± 5,33 нмол.г−1 FW; 5А рәсем) һәм O2•− (32,69 ± 8,56 нмол.г−1 FW; 5В рәсем) туплануын сизелерлек киметә. 72 сәгатьтә. HPT астында H2O2 һәм O2•− югары дәрәҗәдә тупланган (5А, В рәсемнәр). Шулай ук, TCA нигезендәге малониальдегид (MDA) анализы S. sclerotiorum белән зарарланган фасоль үсемлекләренең яфракларында MDA югарырак дәрәҗәдә (113,48 ± 10,02 нмоль.г fr wt) туплануын күрсәтте (5С рәсем). Ләкин, L-орнитинны экзоген куллану липид пероксидациясен сизелерлек киметте, бу эшкәртелгән үсемлекләрдә MDA күләменең кимүе белән раслана (33,08 ± 4,00 нмоль.г fr wt).
5 нче рәсем. Парник шартларында инфекциядән соң 72 сәгатьтән соң S. sclerotiorum белән зарарланган фасоль яфракларында оксидлашу стрессының төп маркерларына һәм ферментатив булмаган антиоксидант саклану механизмнарына экзоген L-орнитин куллануның йогынтысы. (A) 72 ат көчендә водород перекисе (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 ат көчендә супероксид анионы (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 ат көчендә малониальдегид (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 ат көчендә гомуми эри торган феноллар (мг GAE g−1 FW), (E) 72 ат көчендә гомуми эри торган флавоноидлар (мг RE g−1 FW), (F) 72 ат көчендә гомуми ирекле аминокислоталар (мг g−1 FW), һәм (G) 72 ат көчендә пролин күләме (мг g−1 FW). Кыйммәтләр 5 биологик кабатлауның уртача ± стандарт тайпылышын (уртача ± SD) күрсәтә (n = 5). Төрле хәрефләр дәвалаулар арасындагы статистик яктан әһәмиятле аермаларны күрсәтә (p < 0,05).