Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS өчен чикләнгән ярдәм күрсәтелә. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Югары йөкләнешле инсулин нанокисәкчәләре (NP) төрле доза формаларында төрле кулланылыш тапты. Бу эшнең максаты - инсулин белән йөкләнгән хитозан нанокисәкчәләре структурасына туңдыру һәм сиптерү белән киптерү процессларының йогынтысын бәяләү, криопротектор буларак маннит белән яки маннитсыз. Без шулай ук ​​бу нанокисәкчәләрнең сыйфатын аларны яңадан эретеп бәяләдек. Сусызландыру алдыннан, хитозан/натрий триполифосфат/инсулин аркылы бәйләнгән нанокисәкчәләрнең кисәкчә зурлыгы 318 нм итеп оптимальләштерелде, PDI 0,18, капсуляция нәтиҗәлелеге 99,4%, ә йөкләнеш 25,01% иде. Реконструкциядән соң, барлык нанокисәкчәләр дә, маннит кулланмыйча туңдыру белән киптерү ысулы белән җитештерелгәннәрдән тыш, үзләренең сферик кисәкчәләр структурасын саклап калдылар. Ике сиптерү ысулы белән киптерелгән маннитлы нанокисәкчәләр белән чагыштырганда, маннитсыз сиптерү белән киптерелгән нанокисәкчәләр дә иң кечкенә уртача кисәкчә зурлыгын (376 нм) һәм иң югары йөкләнеш күрсәттеләр. (25,02%), охшаш капсуляция тизлеге (98,7%) һәм PDI (0,20) белән киптерү яки туңдыру-киптерү ысуллары белән. Маннитсыз сиптерү-киптерү ысулы белән киптерелгән нанокисәкчәләр шулай ук ​​инсулинның иң тиз бүленеп чыгуына һәм күзәнәкләрнең иң югары нәтиҗәлелегенә китерде. Бу эш күрсәткәнчә, сиптерү-киптерү гадәти туңдыру-киптерү ысуллары белән чагыштырганда криопротекторларга мохтаҗлыксыз инсулин нанокисәкчәләрен сусызландыра ала, бу зуррак йөкләү сыйдырышлыгын, түбәнрәк өстәмә таләпләрен һәм эксплуатация чыгымнарын тәэмин итә, бу зур өстенлек бирә.
19221,2,3 елда ачылганнан бирле, инсулин һәм аның фармацевтик препаратлары 1 типтагы диабет (T1DM) һәм 2 типтагы диабет (T1DM) белән авыручыларның гомерен саклап калды. Ләкин, югары молекуляр авырлыктагы аксым буларак үзлекләре аркасында, инсулин җиңел агрегацияләнә, протеолитик ферментлар белән таркала һәм беренче үтеп керү эффекты белән бетерелә. 1 типтагы диабет диагнозы куелган кешеләргә гомерләре буе инсулин инъекцияләре кирәк. Башта 2 типтагы диабет диагнозы куелган күп пациентларга озак вакытлы инсулин инъекцияләре дә кирәк. Көн саен инсулин инъекцияләре бу кешеләр өчен көндәлек авырту һәм уңайсызлыкның җитди чыганагы булып тора, психик сәламәтлеккә тискәре йогынты ясый. Нәтиҗәдә, азрак уңайсызлык тудыра торган инсулин куллануның башка формалары, мәсәлән, авыз аша инсулин куллану, киң өйрәнелә5, чөнки алар дөнья күләмендә якынча 5 миллиард диабет белән авыручы кешенең тормыш сыйфатын торгызырга мөмкинлек бирә.
Нанокисәкчәләр технологиясе авыз аша инсулин кабул итү омтылышларында сизелерлек алга китеш ясады4,6,7. Ул инсулинны нәтиҗәле рәвештә капсулалаштыра һәм тәннең билгеле бер өлешләренә максатчан җиткерү өчен таркалудан саклый. Ләкин, нанокисәкчәләр формулаларын куллануның берничә чикләүләре бар, нигездә, кисәкчәләр суспензияләренең тотрыклылык проблемалары аркасында. Саклау вакытында кайбер агрегацияләр булырга мөмкин, бу инсулин белән тулыландырылган нанокисәкчәләрнең биокулланылышлылыгын киметә8. Моннан тыш, инсулин нанокисәкчәләренең (НК) тотрыклылыгын тәэмин итү өчен нанокисәкчәләр һәм инсулин полимер матрицасының химик тотрыклылыгын да исәпкә алырга кирәк. Хәзерге вакытта туңдырып киптерү технологиясе саклау вакытында теләмәгән үзгәрешләрне булдырмыйча, тотрыклы НКлар булдыру өчен алтын стандарт булып тора9.
Шулай да, туңдыру белән киптерү өчен, боз кристалларының механик көчәнеше белән NPларның сферик структурасына тәэсир итмәү өчен криопротекторлар өстәргә кирәк. Бу лиофилизациядән соң инсулин нанокисәкчәләренең йөкләнешен сизелерлек киметә, чөнки криопротектор авырлык нисбәтенең күп өлешен били. Шуңа күрә, җитештерелгән инсулин NPлары еш кына коры порошок формулаларын, мәсәлән, авыз эченә таблеткалар һәм авыз эченә пленкалар җитештерү өчен яраксыз дип табыла, чөнки инсулинның терапевтик тәрәзәсенә ирешү өчен күп күләмдә коры нанокисәкчәләр кирәк.
Фармацевтика сәнәгатендә сыек фазалардан коры порошоклар җитештерү өчен сиптергеч киптерү - билгеле һәм арзан сәнәгать масштабындагы процесс10,11. Кисәкчәләр формалашу процессын контрольдә тоту берничә биоактив кушылманы дөрес капсуляцияләү мөмкинлеген бирә12,13. Моннан тыш, ул авыз аша кабул итү өчен капсуляцияләнгән аксымнар әзерләү өчен нәтиҗәле ысулга әйләнде. Сиптергеч киптерү вакытында су бик тиз парга әйләнә, бу кисәкчә үзәгенең температурасын түбән тотарга ярдәм итә11,14, аны җылылыкка сизгер компонентларны капсуляцияләү өчен кулланырга мөмкинлек бирә. Сиптергеч киптерү алдыннан каплау материалы капсуляцияләнгән ингредиентларны үз эченә алган эремә белән тулысынча гомогенлаштырылырга тиеш11,14. Туңдырып киптерүдән аермалы буларак, сиптергеч киптерүдә капсуляция алдыннан гомогенлаштыру сусызландыру вакытында капсуляция нәтиҗәлелеген яхшырта. Сиптергеч киптерү процессы криопротекторлар таләп итмәгәнлектән, сиптергеч киптерү югары йөкләнешле киптерелгән NPлар җитештерү өчен кулланылырга мөмкин.
Бу тикшеренүдә хитозан һәм натрий триполифосфатын ион геле ысулы ярдәмендә үзара бәйләү юлы белән инсулин белән тулыландырылган NP җитештерү турында хәбәр ителә. Ион геляциясе - билгеле бер шартларда ике яки аннан да күбрәк ион төре арасындагы электростатик үзара бәйләнеш аша нанокисәкчәләр җитештерү мөмкинлеген бирә торган әзерләү ысулы. Оптимальләштерелгән хитозан/натрий триполифосфат/инсулин үзара бәйләнгән нанокисәкчәләрне сусызландыру өчен туңдырып киптерү һәм сиптереп киптерү ысуллары кулланылды. Сусызландырудан соң, аларның морфологиясе SEM ярдәмендә анализланды. Аларның рекомбинация сәләте аларның зурлык бүленешен, өслек зарядын, PDI, капсуляция нәтиҗәлелеген һәм йөкләү эчтәлеген үлчәү юлы белән бәяләнде. Төрле сусызландыру ысуллары белән җитештерелгән эрегән нанокисәкчәләрнең сыйфаты шулай ук ​​аларның инсулинны саклау, чыгару үзенчәлекләрен һәм күзәнәк сеңдерү нәтиҗәлелеген чагыштыру юлы белән бәяләнде.
Катнаш эремәнең pH дәрәҗәсе һәм хитозан һәм инсулин нисбәте - соңгы NPларның кисәкчәләр зурлыгына һәм капсуляция нәтиҗәлелегенә (EE) йогынты ясаучы ике төп фактор, чөнки алар турыдан-туры ионотроп гельләшү процессына тәэсир итә. Катнаш эремәнең pH дәрәҗәсе кисәкчәләр зурлыгы һәм капсуляция нәтиҗәлелеге белән югары дәрәҗәдә корреляцияләнгән (1a рәсем). 1a рәсемдә күрсәтелгәнчә, pH 4,0 дән 6,0 га кадәр артканда, уртача кисәкчәләр зурлыгы (nm) кимегән һәм EE сизелерлек арткан, ә pH 6,5 кә кадәр артканда, уртача кисәкчәләр зурлыгы арта башлаган һәм EE үзгәрешсез калган. Хитозанның инсулинга нисбәте артканда, уртача кисәкчәләр зурлыгы да арта. Моннан тыш, нанокисәкчәләр хитозан/инсулинның масса нисбәтен 2,5:1 (w/w) тан югарырак итеп әзерләгәндә EE үзгәреше күзәтелмәгән (1b рәсем). Шуңа күрә, бу тикшеренүдә оптималь әзерләү шартлары (pH 6,0, хитозан/инсулин масса нисбәте 2,5:1) инсулин белән тулыландырылган нанокисәкчәләрне алга таба өйрәнү өчен әзерләү өчен кулланылды. Бу әзерләү шартында инсулин нанокисәкчәләренең уртача кисәкчә зурлыгы 318 нм итеп оптимальләштерелде (1c рәсем), PDI 0,18, урнаштыру нәтиҗәлелеге 99,4%, дзета потенциалы 9,8 мв һәм инсулин йөкләнеше 25,01% (м/м) иде. Трансмиссия электрон микроскопиясе (TEM) нәтиҗәләренә нигезләнеп, оптимальләштерелгән нанокисәкчәләр якынча сферик һәм дискрет, чагыштырмача бердәм зурлыкта иде (1d рәсем).
Инсулин нанокисәкчәләренең параметрларын оптимальләштерү: (а) рНның инсулин нанокисәкчәләренең уртача диаметрына һәм капсуляция нәтиҗәлелегенә (ЭЭ) йогынтысы (хитозан һәм инсулинның 5:1 масса нисбәтендә әзерләнгән); (б) хитозан һәм инсулин масса нисбәтенең инсулин NPларының уртача диаметрына һәм капсуляция нәтиҗәлелегенә (ЭЭ) йогынтысы (рН 6да әзерләнгән); (в) оптимальләштерелгән инсулин нанокисәкчәләренең кисәкчә зурлыклары бүленеше; (г) оптимальләштерелгән инсулин NPларының TEM микрографиясе.
Хитозанның pKa 6,5 ​​булган көчсез полиэлектролит булуы билгеле. Ул кислоталы мохиттә уңай зарядлы, чөнки аның төп амин төркеме водород ионнары белән протонлаштырылган15. Шуңа күрә ул еш кына тискәре зарядлы макромолекулаларны каплау өчен ташучы буларак кулланыла. Бу тикшеренүдә хитозан 5,3 изоэлектрик ноктасы булган инсулинны каплау өчен кулланылды. Хитозан каплау материалы буларак кулланылганлыктан, аның пропорциясе арткан саен, нанокисәкчәләрнең тышкы катламының калынлыгы да арта, бу исә уртача кисәкчә зуррак булуына китерә. Моннан тыш, хитозанның югарырак дәрәҗәләре күбрәк инсулинны каплауга мөмкинлек бирә. Безнең очракта, хитозан һәм инсулин нисбәте 2,5:1 гә җиткәндә, ЭЭ иң югары булган, һәм нисбәт артканда, ЭЭда әһәмиятле үзгәрешләр булмаган.
Хитозан һәм инсулин нисбәтеннән тыш, рН да NP әзерләүдә мөһим роль уйнады. Ган һ.б. 17 хитозан нанокисәкчәләренең кисәкчәләре зурлыгына рН йогынтысын өйрәнделәр. Алар рН 6,0 га җиткәнче кисәкчәләр зурлыгының өзлексез кимүен ачыкладылар, һәм рН > 6,0 булганда кисәкчәләр зурлыгының сизелерлек артуы күзәтелде, бу безнең күзәтүләр белән туры килә. Бу күренеш рН арткан саен, инсулин молекуласы тискәре өслек заряды ала, шулай итеп, хитозан/натрий триполифосфаты (TPP) комплексы белән электростатик үзара бәйләнешкә өстенлек бирә, нәтиҗәдә кисәкчәләр зурлыгы кечерәк һәм югары EE барлыкка килә. Ләкин, рН 6,5 кә көйләнгәндә, хитозандагы амин төркемнәре депротонацияләнде, нәтиҗәдә хитозан бөкләнүе барлыкка килде. Шулай итеп, югары рН амин ионнарының TPP һәм инсулинга азрак тәэсир итүенә китерә, нәтиҗәдә кисәкчәләр арасындагы бәйләнеш түбәнрәк, уртача кисәкчәләр зуррак һәм EE түбәнрәк була.
Туңдырылган һәм сиптергеч белән киптерелгән NPларның морфологик үзенчәлекләрен анализлау яхшырак сусызландыру һәм порошок формалаштыру ысулларын сайларга ярдәм итә ала. Өстенлекле ысул препаратның тотрыклылыгын, тигез кисәкчәләр формасын, югары препарат йөкләнешен һәм оригиналь эремәдә яхшы эрүчәнлекне тәэмин итәргә тиеш. Бу тикшеренүдә, ике ысулны яхшырак чагыштыру өчен, сусызландыру вакытында 1% маннитоллы яки аннан башка инсулин NPлары кулланылды. Маннитол туңдырылган һәм сиптергеч белән киптерү өчен төрле коры порошок формулаларында күләм җыючы агент яки криопротектор буларак кулланыла. Маннитолсыз лиофилизацияләнгән инсулин нанокисәкчәләре өчен, 2a рәсемдә күрсәтелгәнчә, сканерлаучы электрон микроскопиясе (SEM) астында зур, тигез булмаган һәм тупас өслекле югары күзәнәкле порошок структурасы күзәтелде. Сусызландырудан соң порошокта аз санлы дискрет кисәкчәләр табылды (2e рәсем). Бу нәтиҗәләр күпчелек NPларның криопротекторсыз туңдырылган киптерү вакытында таркалуын күрсәтте. 1% маннитоллы туңдырылган һәм сиптергеч белән киптерелгән инсулин нанокисәкчәләре өчен шома өслекле сферик нанокисәкчәләр күзәтелде (1 нче рәсем). 2b,d,f,h). Маннитсыз сиптереп киптерелгән инсулин нанокисәкчәләре сферик булып калган, ләкин өслегендә җыерчыклар калган (2c рәсем). Сферик һәм җыерчыклы өслекләр түбәндәге чыгару тәртибе һәм күзәнәк сеңдерү тестларында өстәмә рәвештә карала. Киптерелгән NPларның күренмәле күренешенә нигезләнеп, маннитсыз сиптереп киптерелгән NPлар да, маннит белән туңдырып киптерелгән һәм сиптереп киптерелгән NPлар да вак NP порошокларын биргән (2f,g,h рәсем). Кисәкчәләр өслекләре арасындагы өслек мәйданы зуррак булган саен, эрүчәнлек югарырак һәм шуңа күрә чыгару тизлеге югарырак.
Төрле киптерелгән инсулин NPларының морфологиясе: (а) маннитсыз лиофилизацияләнгән инсулин NPларының SEM сурәте; (б) маннитлы лиофилизацияләнгән инсулин NPларының SEM сурәте; (в) маннитсыз сиптереп киптерелгән инсулин NPларының SEM сурәте; (г) маннитлы сиптереп киптерелгән инсулин NPларының SEM сурәте; (д) маннитсыз лиофилизацияләнгән инсулин NPларының порошогы сурәте; (е) маннитлы лиофилизацияләнгән инсулин NPларының сурәте; (г) маннитсыз сиптереп киптерелгән инсулин NPларының сурәте; (з) маннитлы сиптереп киптерелгән инсулин NPларының сурәте.
Туңдыру белән киптерү вакытында маннит криопротектор булып эшли, NPларны аморф формада тота һәм боз кристаллары белән зыян күрүне булдырмый19. Киресенчә, сиптерү белән киптерү вакытында туңдыру этабы юк. Шуңа күрә бу ысулда маннит кирәк түгел. Чынлыкта, маннитсыз сиптерү белән киптерелгән NPлар, элек тасвирланганча, вак NPлар бирде. Шулай да, маннит сиптерү белән киптерү процессында тутыргыч булып эшли ала, NPларга күбрәк сферик структура бирә20 (2d рәсем), бу мондый капсулаланган NPларның бердәм бүленеп чыгу тәртибен тәэмин итәргә ярдәм итә. Моннан тыш, маннитлы туңдыру белән киптерелгән һәм сиптерү белән киптерелгән инсулин NPларында кайбер зур кисәкчәләрне ачыкларга мөмкин булуы ачык (2b,d рәсем), бу капсулаланган инсулин белән бергә кисәкчә үзәгендә маннит туплану белән бәйле булырга мөмкин. Хитозан катламына. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, бу тикшеренүдә, сусызландырудан соң сферик структураның бөтенлеген тәэмин итү өчен, маннитол һәм хитозан нисбәте 5:1 күләмендә саклана, шуңа күрә күп күләмдәге тутыргыч киптерелгән NP кисәкчәләренең зурлыгын да арттыра ала.
Фурье трансформациясе белән инфракызыл сүндерелгән тулы чагылыш (FTIR-ATR) спектроскопиясе ирекле инсулин, хитозан, хитозан, TPP һәм инсулинның физик катнашмасын характерлады. Барлык киптерелгән NPлар FTIR-ATR спектроскопиясе ярдәмендә характерланды. Шунысы игътибарга лаек, маннитол белән туңдырылып киптерелгән капсулаланган NPларда һәм маннитол белән һәм маннитолсыз сиптереп киптерелгән NPларда 1641, 1543 һәм 1412 см-1 полоса интенсивлыгы күзәтелде (3 нче рәсем). Элегрәк хәбәр ителгәнчә, көчнең бу артуы хитозан, TPP һәм инсулин арасындагы үзара бәйләнеш белән бәйле иде. Хитозан һәм инсулин арасындагы үзара бәйләнешне тикшерү инсулин белән тулыландырылган хитозан нанокисәкчәләренең FTIR спектрларында хитозан полосасы инсулин полосасы белән капланып, карбонил интенсивлыгын (1641 см-1) һәм амин (1543 см-1) поясын арттырганын күрсәтте. TPP триполифосфат төркемнәре хитозандагы аммоний төркемнәре белән бәйләнгән, 1412 см-1 зурлыкта тасма барлыкка китерә.
Ирекле инсулинның FTIR-ATR спектрлары, хитозан, хитозан/TPP/инсулинның физик катнашмалары һәм төрле ысуллар белән дегидратланган NPлар.
Моннан тыш, бу нәтиҗәләр SEMда күрсәтелгән нәтиҗәләр белән туры килә, алар капсулаланган NPларның маннитол белән сиптергәндә дә, туңдырып киптергәндә дә бөтен килеш калуын күрсәтте, ләкин маннитол булмаганда, бары тик сиптереп киптерү генә капсулаланган кисәкчәләр барлыкка китерде. Киресенчә, маннитолсыз туңдырып киптерелгән NPларның FTIR-ATR спектраль нәтиҗәләре хитозан, TPP һәм инсулинның физик катнашмасына бик охшаш иде. Бу нәтиҗә хитозан, TPP һәм инсулин арасындагы бәйләнешләрнең маннитолсыз туңдырып киптерелгән NPларда инде булмавын күрсәтә. NP структурасы криопротекторсыз туңдырып киптерү вакытында җимерелде, моны SEM нәтиҗәләреннән күрергә мөмкин (2а рәсем). Киптерелгән инсулин NPларының морфологиясе һәм FTIR нәтиҗәләренә нигезләнеп, маннитолсыз NPларның таркалуы аркасында торгызу экспериментлары һәм маннитолсыз NPлар өчен бары тик лиофилизацияләнгән, сиптереп киптерелгән һәм маннитолсыз NPлар гына кулланылды. сусызлану. фикер алышу.
Озак вакыт саклау һәм башка формулаларга эшкәртү өчен дегидратация кулланыла. Коры NPларның саклаганнан соң яңадан формалашу сәләте аларны төрле формулаларда, мәсәлән, таблеткаларда һәм пленкаларда куллану өчен бик мөһим. Без маннит булмаганда сиптереп киптерелгән инсулин NPларының уртача кисәкчә зурлыгы яңадан формалаштырылганнан соң бераз гына артканлыгын күрдек. Икенче яктан, сиптереп киптерелгән һәм туңдырып киптерелгән инсулин нанокисәкчәләренең кисәкчә зурлыгы маннит белән сизелерлек арткан (1 нче таблица). Бу тикшеренүдә барлык NPларны рекомбинацияләгәннән соң PDI һәм EE сизелерлек үзгәрмәгән (p > 0,05). Бу нәтиҗә кисәкчәләрнең күбесе яңадан эретелгәннән соң да бөтен калганлыгын күрсәтә. Ләкин, маннит өстәү лиофилизацияләнгән һәм сиптереп киптерелгән маннит нанокисәкчәләренең инсулин йөкләнешен сизелерлек киметүгә китергән (1 нче таблица). Киресенчә, маннитсыз сиптереп киптерелгән NPларның инсулин йөкләнеше элеккеге кебек үк калган (1 нче таблица).
Даруларны китерү максатларында кулланылганда нанокисәкчәләрне йөкләү бик мөһим икәне билгеле. Түбән йөкләнешле NPлар өчен терапевтик чиккә җитү өчен бик күп күләмдә материал кирәк. Ләкин, мондый югары NP концентрацияләренең югары ябышлыгы авыз аша кабул итүдә һәм инъекция формулаларында уңайсызлыклар һәм кыенлыклар тудыра 22. Моннан тыш, инсулин NPлары таблеткалар һәм ябышчаклы биофильмнар ясау өчен дә кулланылырга мөмкин 23, 24, бу түбән йөкләнеш дәрәҗәсендә күп күләмдә NPлар куллануны таләп итә, нәтиҗәдә авыз аша куллану өчен яраклы булмаган зур таблеткалар һәм калын биофильмнар барлыкка килә. Шуңа күрә, югары инсулин йөкләнеше булган киптерелгән NPлар бик кирәкле. Безнең нәтиҗәләр маннитолсыз сиптергеч белән киптерелгән NPларның югары инсулин йөкләнеше бу альтернатив китерү ысуллары өчен күп кенә җәлеп итүчән өстенлекләр бирә алуын күрсәтә.
Барлык киптерелгән NPлар суыткычта өч ай сакланды. SEM нәтиҗәләре күрсәткәнчә, өч айлык саклау вакытында барлык киптерелгән NPларның морфологиясе сизелерлек үзгәрмәде (4 нче рәсем). Суда эретелгәннән соң, барлык NPларда да EE бераз кимүе күзәтелде һәм өч айлык саклау чорында якынча аз күләмдә (~5%) инсулин бүлеп чыгарылды (2 нче таблица). Ләкин барлык нанокисәкчәләрнең уртача кисәкчә зурлыгы артты. Маннитолсыз сиптереп киптерелгән NPларның кисәкчә зурлыгы 525 нм га кадәр артты, ә маннитол белән сиптереп киптерелгән һәм туңдырып киптерелгән NPларның кисәкчә зурлыгы 872 һәм 921 нм га кадәр артты (2 нче таблица).
Өч ай дәвамында сакланган төрле киптерелгән инсулин NPларының морфологиясе: (а) маннитлы лиофилизацияләнгән инсулин NPларының SEM сурәте; (б) маннитсыз сиптереп киптерелгән инсулин нанокисәкчәләренең SEM сурәте; (в) маннитсыз сиптереп киптерелгән инсулин NPларының SEM сурәтләре.
Моннан тыш, маннит белән сиптереп киптерелгән һәм туңдырылып киптерелгән инсулин нанокисәкчәләрендә чөкмәләр күзәтелгән (S2 рәсем). Бу зур кисәкчәләрнең суда дөрес суспензияләнмәве аркасында килеп чыгарга мөмкин. Югарыдагы барлык нәтиҗәләр дә сиптереп киптерү ысулының инсулин нанокисәкчәләрен сусызланудан саклый алуын һәм инсулин нанокисәкчәләренең югары күләмен бернинди тутыргычлар яки криопротекторларсыз алып була алуын күрсәтә.
Инсулин тоткарлануы рН = 2,5 мохиттә пепсин, трипсин һәм α-химотрипсин белән сыналган, бу NPларның сусызланудан соң ферментатив ашкайнатудан саклау сәләтен күрсәтү өчен. Сусызландырылган NPларның инсулин тоткарлануы яңа әзерләнгән NPлар белән чагыштырылган, һәм ирекле инсулин тискәре контроль буларак кулланылган. Бу тикшеренүдә ирекле инсулин өч ферментатив эшкәртүдә дә 4 сәгать эчендә инсулинның тиз бетерелүен күрсәткән (5a–c рәсем). Киресенчә, маннитол белән туңдырылып киптерелгән NPларның һәм маннитол белән яки маннитолсыз спрей белән киптерелгән NPларның инсулин бетерелүен сынау бу NPларның ферментатив ашкайнатудан күпкә югарырак саклануын күрсәтте, бу яңа әзерләнгән инсулин NPларына охшаш иде (1 нче рәсем). 5a-c). Пепсин, трипсин һәм α-химотрипсиндагы нанокисәкчәләр ярдәмендә инсулинның 50%, 60% һәм 75% тан артыгы 4 сәгать эчендә сакланырга мөмкин иде (5a–c рәсем). Бу инсулинны саклау сәләте канга инсулинның югарырак сеңү мөмкинлеген арттырырга мөмкин25. Бу нәтиҗәләр маннит белән яки маннитсыз сиптереп киптерү һәм маннит белән туңдырып киптерү сусызландырудан соң NPларның инсулинны саклау сәләтен саклап кала ала дип күрсәтә.
Киптерелгән инсулин NPларының саклану һәм бүленеп чыгу үзенчәлеге: (а) пепсин эремәсендә инсулинны саклау; (б) трипсин эремәсендә инсулинны саклау; (в) инсулинны α-химотрипсин эремәсе белән саклау; (г) pH = 2,5 эремәсендә киптерелгән NPларның бүленеп чыгу үзенчәлеге; (д) pH = 6,6 эремәсендә киптерелгән NPларның бүленеп чыгу үзенчәлеге; (е) pH = 7,0 эремәсендә киптерелгән NPларның бүленеп чыгу үзенчәлеге.
Яңа әзерләнгән һәм торгызылган коры инсулин NP'лары, инсулинның инсулинга каршы торучанлыкка йогынтысын тикшерү өчен, ашказаны, уникеилле эчәк һәм югары нечкә эчәкнең рН мохитен симуляцияләп, 37 °C температурада төрле буферларда (рН = 2.5, 6.6, 7.0) инкубацияләнде. Төрле мохиттә чыгару тәртибе. Ашкайнату тракты фрагменты. pH = 2,5 булганда, инсулин белән тулыландырылган NPлар һәм эрегән коры инсулин NPлары беренче бер сәгать эчендә башлангыч шартлау белән чыгаруны күрсәттеләр, аннары киләсе 5 сәгать эчендә әкренләп чыгару булды (5d рәсем). Баштагы бу тиз чыгару, мөгаен, кисәкчәнең эчке структурасында тулысынча иммобилизацияләнмәгән аксым молекулаларының тиз өслек десорбциясе нәтиҗәсе. pH = 6,5 булганда, инсулин белән тулыландырылган NPлар һәм яңадан төзелгән коры инсулин NPлары 6 сәгать эчендә шома һәм әкрен чыгаруны күрсәттеләр, чөнки сынау эремәсенең pHы NPлар белән әзерләнгән эремәгә охшаш иде (5e рәсем). pH = 7 булганда, NPлар тотрыксыз иде һәм беренче ике сәгать эчендә тулысынча диярлек таркалды (5f рәсем). Чөнки хитозанның депротонациясе югарырак pHта бара, бу азрак компакт полимер челтәренә һәм йөкләнгән инсулинның чыгарылуына китерә.
Моннан тыш, маннитолсыз сиптергеч белән киптерелгән инсулин NP'лары башка киптерелгән NP'ларга караганда тизрәк аерылу профилен күрсәттеләр (5d–f рәсем). Элегрәк тасвирланганча, маннитолсыз киптерелгән торгызылган инсулин NP'лары иң кечкенә кисәкчә зурлыгын күрсәттеләр. Кечкенә кисәкчәләр зуррак өслек мәйданы бирә, шуңа күрә препаратның күпчелек өлеше кисәкчәләр өслегендә яки аның янында булачак, нәтиҗәдә препарат тиз аерыла26.
NPларның цитотоксиклыгы MTT анализы ярдәмендә тикшерелде. S4 рәсемендә күрсәтелгәнчә, барлык киптерелгән NPларның да 50–500 мкг/мл концентрациясендә күзәнәк яшәүчәнлегенә әһәмиятле йогынты ясамавы ачыкланды, бу барлык киптерелгән NPларны терапевтик тәрәзәгә җитү өчен куркынычсыз кулланырга мөмкин булуын күрсәтә.
Бавыр - инсулин үзенең физиологик функцияләрен үтәгән төп орган. HepG2 күзәнәкләре - кеше гепатома күзәнәк линиясе, гадәттә in vitro гепатоцитларны үзләштерү моделе буларак кулланыла. Монда HepG2 күзәнәкләре туңдыру һәм сиптерү белән киптерү ысуллары белән киптерелгән NPларның күзәнәк үзләштерүен бәяләү өчен кулланылды. Конфокаль лазер сканерлау ярдәмендә агым цитометриясе һәм күрү ярдәмендә күзәнәк үзләштерү 25 мкг/мл концентрациясендә ирекле FITC инсулины белән берничә сәгать инкубациядән соң, яңа әзерләнгән FITC инсулинлы NPлар һәм тигез инсулин концентрацияләрендә киптерелгән FITC инсулинлы NPлар. Санлы микроскопия (CLSM) күзәтүләре үткәрелде. Маннитолсыз лиофилизланган NPлар сусызландыру вакытында юк ителде һәм бу тестта бәяләнмәде. Яңа әзерләнгән инсулинлы NPларның, маннитол белән лиофилизланган NPларның һәм маннитол белән һәм маннитолсыз сиптерү белән киптерелгән NPларның (6а рәсем) күзәнәк эчендәге флуоресценция интенсивлыгы 4,3 иде, иреклеләргә караганда 2,6, 2,4 һәм 4,1 тапкыр югарырак. FITC-инсулин төркеме, тиешенчә (6б рәсем). Бу нәтиҗәләр капсулаланган инсулинның ирекле инсулинга караганда күзәнәкләр тарафыннан сеңдерелүен күрсәтә, бу, нигездә, тикшеренүдә барлыкка килгән инсулин белән тулы нанокисәкчәләрнең кечерәк зурлыгы аркасында.
Яңа әзерләнгән NP һәм киптерелгән NP белән 4 сәгать инкубациядән соң HepG2 күзәнәкләренең үзләштерелүе: (a) HepG2 күзәнәкләре тарафыннан FITC-инсулин үзләштерелүенең бүленеше.(b) Агым цитометриясе ярдәмендә анализланган флуоресценция интенсивлыгының геометрик уртача кыйммәте (n = 3), *P < 0,05 ирекле инсулин белән чагыштырганда.
Шулай ук, CLSM рәсемнәре күрсәткәнчә, яңа әзерләнгән FITC-инсулинлы NPларның һәм FITC-инсулинлы сиптергеч белән киптерелгән NPларның (маннитсыз) FITC флуоресценция интенсивлыгы башка үрнәкләргә караганда күпкә көчлерәк булган (6а рәсем). Моннан тыш, маннит өстәлгәндә, эремәнең югарырак ябышлыгы күзәнәк сеңдерүгә каршы торучанлыкны арттырган, нәтиҗәдә инсулин пролиферациясе кимегән. Бу нәтиҗәләр маннитсыз сиптергеч белән киптерелгән NPларның иң югары күзәнәк сеңдерү нәтиҗәлелеген күрсәтүен күрсәтә, чөнки аларның кисәкчәләренең зурлыгы кабат эретелгәннән соң туңдырылган киптерелгән NPларга караганда кечерәк булган.
Хитозан (уртача молекуляр авырлыгы 100 кДа, 75–85% деацетилләнгән) Sigma-Aldrich компаниясеннән сатып алынган. (Оаквилл, Онтарио, Канада). Натрий триполифосфаты (TPP) VWR компаниясеннән (Раднор, Пенсильвания, АКШ) сатып алынган. Бу тикшеренүдә кулланылган рекомбинант кеше инсулины Fisher Scientific компаниясеннән (Уолтем, Массачусетс, АКШ). Флуоресцеин изотиоцианаты (FITC) белән билгеләнгән кеше инсулины һәм 4′,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлориды (DAPI) Sigma-Aldrich компаниясеннән сатып алынган. (Оаквилл, Онтарио, Канада). HepG2 күзәнәк линиясе ATCC компаниясеннән (Манасса, Вирджиния, АКШ) алынган. Башка барлык реагентлар да аналитик яки хроматографик дәрәҗәдә булган.
1 мг/мл CS эремәсен 0,1% сиркә кислотасы булган икеләтә дистилляцияләнгән суда (DD суында) эретеп әзерләгез. 1 мг/мл TPP һәм инсулин эремәләрен DD суында һәм 0,1% сиркә кислотасында эретеп әзерләгез. Алдан эмульсия политрон PCU-2-110 югары тизлекле гомогенизаторы (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA) белән әзерләнде. Әзерләү процессы түбәндәгечә: башта 4 мл инсулин эремәсенә 2 мл TPP эремәсе өстәлә, катнашма 30 минут болгата һәм тулысынча болгата. Аннары катнаш эремә CS эремәсенә тамчылатып шприц аша югары тизлекле болгату (10,000 әйләнү/мин) астында өстәлде. Катнашмалар бозлы ваннада 30 минут югары тизлекле болгату (15,000 әйләнү/мин) астында тотылды, һәм алар билгеле бер рН дәрәҗәсенә көйләнде, аркылы бәйләнгән инсулин NPлары алынды. Инсулин NPларының кисәкчәләренең зурлыгын тагын да гомогенлаштыру һәм киметү өчен, алар... бозлы ваннада зонд тибындагы ультрадыбыс җайланмасы ярдәмендә өстәмә 30 минут дәвамында ультратавыш белән эшкәртелде (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Германия).
Инсулин NPSлары Z-уртача диаметр, полидисперслык индексы (PDI) һәм дзета потенциалы өчен Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Австрия) ярдәмендә 25°C температурада DD суда сыеклатып динамик яктылык сибелү (DLS) үлчәүләре ярдәмендә тикшерелде. Морфология һәм зурлык бүленеше Hitachi H7600 тапшыру электрон микроскобы (TEM) (Hitachi, Токио, Япония) ярдәмендә характерланды, һәм аннан соң сурәтләр Hitachi сурәтләү программасы (Hitachi, Токио, Япония) ярдәмендә анализланды. Инсулин NPларының капсуляция нәтиҗәлелеген (EE) һәм йөкләү сыйдырышлыгын (LC) бәяләү өчен, NPлар 100 кДа молекуляр авырлык чиге белән ультрафильтрация пробиркаларына пипетка белән салынды һәм 500 xg тизлектә 30 минут дәвамында центрифугаланды. Фильтраттагы капсулаланмаган инсулин дүртенчел насостан торган Agilent 1100 серияле HPLC системасы (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, АКШ) ярдәмендә санлаштырылды, автосамплер, колонка җылыткычы һәм DAD детекторы. Инсулин C18 колонкасы (Zorbax, 3.5 мкм, 4.6 мм × 150 мм, Agilent, АКШ) ярдәмендә анализланды һәм 214 нм диапазонда ачыкланды. Күчмә фаза ацетонитрил һәм судан торды, составында 0.1% TFA бар, градиент нисбәте 10/90 тан 100/0 гә кадәр иде һәм 10 минут эшләде. Күчмә фаза 1.0 мл/мин агым тизлегендә суыртылды. Колонка температурасы 20 °C итеп билгеләнде. (1) һәм (2) тигезләмәләрен кулланып, EE һәм LC процентларын исәпләгез.
Инсулин NP ны оптимальләштерү өчен 2,0 дән 4,0 гә кадәр төрле CS/инсулин нисбәтләре сынап каралды. Әзерләү барышында төрле күләмдә CS эремәсе өстәлде, ә инсулин/TPP катнашмасы даими сакланды. Инсулин NP лары барлык эремәләрне (инсулин, TPP һәм CS) өстәгәннән соң катнашманың рН дәрәҗәсен игътибар белән контрольдә тоту юлы белән 4,0 дән 6,5 кә кадәр рН диапазонында әзерләнде. Инсулин NP формалашуын оптимальләштерү өчен инсулин нанокисәкчәләренең EE һәм кисәкчә зурлыгы төрле рН кыйммәтләрендә һәм CS/инсулин масса нисбәтләрендә бәяләнде.
Оптимальләштерелгән инсулин NP-лары алюминий савытка урнаштырылды һәм бераз скотч белән тыгызланган тукымалар белән капланды. Аннары, винтланган савытлар таба киптергеч белән җиһазландырылган Labconco FreeZone туңдыргыч киптергеченә (Labconco, Канзас-Сити, Миссури, АКШ) урнаштырылды. Коры инсулин NP-ларын алу өчен температура һәм вакуум басымы -10 °C, беренче 2 сәгать өчен 0,350 Торр, ә 24 сәгатьнең калган 22 сәгатендә 0 °C һәм 0,120 Торр итеп билгеләнде.
Капсулаланган инсулин җитештерү өчен Buchi Mini спрей киптергече B-290 (BÜCHI, Flawil, Швейцария) кулланылды. Сайланган киптерү параметрлары: температура 100 °C, туклану агымы 3 л/мин һәм газ агымы 4 л/мин.
Сусызлануга кадәр һәм аннан соң инсулин NP-лары FTIR-ATR спектроскопиясе ярдәмендә характерланды. Сусызландырылган нанокисәкчәләр, шулай ук ​​ирекле инсулин һәм хитозан универсаль ATR үрнәк алу аксессуары белән җиһазландырылган Spectrum 100 FTIR спектрофотометры (PerkinElmer, Waltham, Массачусетс, АКШ) ярдәмендә анализланды (PerkinElmer, Waltham, Массачусетс, АКШ). Сигнал уртача күрсәткечләре 4000-600 см2 ешлык диапазонында 4 см2 ачыклыкта 16 сканерлаудан алынды.
Коры инсулин NPларының морфологиясе Helios NanoLab 650 фокуслы ион нурларын сканерлаучы электрон микроскоп (FIB-SEM) (FEI, Хиллсборо, Орегон, АКШ) белән төшерелгән туңдырылган һәм сиптерү юлы белән киптерелгән инсулин NPларының SEM сурәтләре ярдәмендә бәяләнде. Кулланылган төп параметр 5 кэВ көчәнеш һәм 30 мА ток иде.
Барлык киптерелгән инсулин NPлары dd суда яңадан эретелде. Киптерелгәннән соң аларның сыйфатын бәяләү өчен, кисәкчәләр зурлыгы, PDI, EE һәм LC алдан искә алынган шул ук ысул белән кабат тикшерелде. Ангидроинсулин NPларының тотрыклылыгы шулай ук ​​озак сакланганнан соң NPларның үзлекләрен сынап карау юлы белән үлчәнде. Бу тикшеренүдә, киптерелгәннән соң барлык NPлар суыткычта өч ай сакланды. Өч ай сакланганнан соң, NPлар морфологик кисәкчәләр зурлыгы, PDI, EE һәм LC буенча тикшерелде.
Инсулинның сусызланудан соң NPларны саклаудагы нәтиҗәлелеген бәяләү өчен, 5 мл торгызылган NPларны симуляцияләнгән ашказаны сыекчасында (рН 1.2, 1% пепсин), эчәк сыекчасында (рН 6.8, 1% трипсин) яки химотрипсин эремәсендә (100 г/мл, фосфат буферында, рН 7.8) 45 мл эретегез. Алар 37°C температурада 100 әйләнү/мин болгату тизлегендә инкубацияләнде. Төрле вакыт нокталарында 500 мкл эремә җыелды һәм инсулин концентрациясе HPLC ярдәмендә билгеләнде.
Яңа әзерләнгән һәм сусызландырылган инсулин NPларының in vitro бүленеп чыгу үзенчәлеге диализ капчыгы ысулы белән тикшерелде (молекуляр авырлык чикләүе 100 кДа, Spectra Por Inc.). Яңа әзерләнгән һәм торгызылган коры NPлар ашказаны, уникеилле эчәк һәм югары нечкә эчәкнең pH мохитен симуляцияләү өчен pH 2,5, pH 6,6 һәм pH 7,0 (0,1 М фосфат-буферланган тозлы эремә, PBS) сыеклыкларында диализланды. Барлык үрнәкләр дә 37 °C температурада 200 әйләнү/мин тизлегендә өзлексез селкетү белән инкубацияләнде. 5 мл диализ капчыгы тышындагы сыеклыкны түбәндәге вакытларда сорыгыз: 0,5, 1, 2, 3, 4 һәм 6 сәгать, һәм шунда ук күләмне яңа диализат белән тутырыгыз. Сыеклыктагы инсулин пычрануы HPLC ярдәмендә анализланды, һәм нанокисәкчәләрдән инсулин бүленеп чыгу тизлеге бүленеп чыгарылган ирекле инсулинның нанокисәкчәләрдә капланган гомуми инсулинга нисбәтеннән исәпләнде. (3 нче тигезләмә).
Кеше бавыр клеткалы карциномасы күзәнәк линиясе HepG2 күзәнәкләре 60 мм диаметрлы савытларда 10% феталь сыер сывороткасы, 100 IU/мл пенициллин һәм 100 мкг/мл стрептомицин29 булган Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) кулланып үстерелде. Культуралар 37°C температурада, 95% чагыштырма дымлылыкта һәм 5% CO2'да сакланды. Уңдыру анализлары өчен HepG2 күзәнәкләре 1 × 105 күзәнәк/мл белән 8 коелы Nunc Lab-Tek камералы слайд системасына (Thermo Fisher, NY, АКШ) чәчелде. Цитотоксик анализлар өчен алар 96 коелы пластиналарга (Corning, NY, АКШ) 5 × 104 күзәнәк/мл тыгызлыгында чәчелде.
MTT анализы яңа әзерләнгән һәм сусызландырылган инсулин NPs30 цитотоксиклыгын бәяләү өчен кулланылды. HepG2 күзәнәкләре 96 коелы пластиналарга 5 × 104 күзәнәк/мл тыгызлыгында чәчелде һәм сынау алдыннан 7 көн дәвамында үстерелде. Инсулин NPлары культура мохитендә төрле концентрацияләргә (50 дән 500 мкг/мл га кадәр) кадәр сыекландырылды, аннары күзәнәкләргә бирелде. 24 сәгать инкубациядән соң, күзәнәкләр PBS белән 3 тапкыр юылды һәм 0,5 мг/мл MTT булган мохиттә өстәмә 4 сәгать инкубацияләнде. Цитотоксиклык 570 нм да Tecan infinite M200 pro спектрофотометр пластинасын укучы (Tecan, Männedorf, Швейцария) ярдәмендә сары тетразолий MTT ның шәмәхә формазанга ферментатив редукциясен үлчәү юлы белән бәяләнде.
NPларның күзәнәк сеңдерү нәтиҗәлелеге конфокаль лазер сканерлау микроскопиясе һәм агым цитометриясе анализы ярдәмендә тикшерелде. Nunc Lab-Tek камера слайд системасының һәр коесы ирекле FITC-инсулин, FITC-инсулин белән тутырылган NPлар белән эшкәртелде һәм шул ук концентрациядә 25 мкг/мл киптерелгән FITC-инсулин NPлары белән яңадан торгызылды һәм 4 сәгать инкубацияләнде. Күзәнәкләр PBS белән 3 тапкыр юылды һәм 4% параформальдегид белән фиксацияләнде. Төшләр 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) белән буялды. Инсулин локализациясе Olympus FV1000 лазер сканерлау/ике фотонлы конфокаль микроскоп (Olympus, Синдзюку шәһәре, Токио, Япония) ярдәмендә күзәтелде. Агым цитометриясе анализы өчен, шул ук концентрациядәге 10 мкг/мл ирекле FITC-инсулин, FITC-инсулин белән тутырылган NPлар һәм эрегән киптерелгән NPлар кулланылды. FITC-инсулин NP'лары HepG2 күзәнәкләре белән орлыкландырылган 96 чокырлы тәлинкәләргә өстәлде һәм 4 сәгать инкубацияләнде. 4 сәгать инкубациядән соң, күзәнәкләр алынды һәм FBS белән 3 тапкыр юылды. Бер үрнәктә 5 × 104 күзәнәк BD LSR II агым цитометры (BD, Franklin Lakes, Нью-Джерси, АКШ) ярдәмендә анализланды.
Барлык кыйммәтләр дә уртача ± стандарт тайпылыш буларак күрсәтелә. Барлык төркемнәр арасындагы чагыштырулар IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Нью-Йорк, АКШ) ярдәмендә берьяклы ANOVA яки t-тест ярдәмендә бәяләнде һәм p < 0,05 статистик яктан әһәмиятле дип табылды.
Бу тикшеренү сиптергеч киптерүнең сыгылмалылыгын һәм сәләтен күрсәтә, алар стандарт туңдыру-киптерү ысуллары белән чагыштырганда яхшырак реконституцияләнә, шулай ук ​​криопротекторлар яки криопротекторлар сыйдырышлылыгы һәм югарырак йөкләнеш сыйдырышлыгы белән киптерелә. Оптимальләштерелгән инсулин нанокисәкчәләре уртача 318 нм кисәкчә зурлыгын һәм 99,4% капсуляция нәтиҗәлелеген бирде. Сусызландырудан соң SEM һәм FTIR нәтиҗәләре сферик структураның маннитлы һәм маннитсыз һәм маннит белән лиофилизацияләнгән сиптергеч киптерелгән NPларда гына сакланганлыгын күрсәтте, ләкин маннитсыз лиофилизацияләнгән NPлар сусызландыру вакытында таркалды. Реконституция сәләтен тикшерүдә, маннитсыз сиптергеч киптерелгән инсулин нанокисәкчәләре иң кечкенә уртача кисәкчә зурлыгын һәм реконституция вакытында иң югары йөкләнешне күрсәтте. Бу барлык киптерелгән NPларның бүленеп чыгу үзенчәлекләре аларның pH = 2,5 һәм pH = 7 эремәләрендә тиз аерылуын һәм pH = 6,5 эремәсендә бик тотрыклы булуын күрсәтте. Башка эретелгән NPлар белән чагыштырганда Сусызландырылган NPларда, маннитолсыз сиптергеч белән киптерелгән NPлар иң тиз аерылу күрсәттеләр. Бу нәтиҗә күзәнәк сеңдерү анализында күзәтелгән нәтиҗәгә туры килә, чөнки маннитол булмаганда сиптергеч белән киптерелгән NPлар яңа әзерләнгән NPларның күзәнәк сеңдерү нәтиҗәлелеген тулысынча диярлек саклады. Бу нәтиҗәләр маннитолсыз сиптергеч белән киптерү юлы белән әзерләнгән коры инсулин нанокисәкчәләренең башка сусыз доза формаларына, мәсәлән, авыз эченә кабул ителә торган таблеткаларга яки биоадгезив пленкаларга эшкәртү өчен иң яраклы булуын күрсәтә.
Интеллектуаль милек мәсьәләләре аркасында, хәзерге тикшеренү барышында булдырылган һәм/яки анализланган мәгълүмат җыелмалары җәмәгатьчелек өчен ачык түгел, ләкин тиешле авторлардан акылга сыярлык үтенеч буенча алырга мөмкин.
Каган, А. 2 нче типтагы диабет: социаль һәм фәнни килеп чыгышы, медицина катлауланулары һәм пациентлар һәм башкалар өчен нәтиҗәләре. (МакФарлейн, 2009).
Сингх, А.П., Гуо, Ю., Сингх, А., Сие, В. һәм Цзян, П. Инсулин капсулаларын эшкәртү: хәзер авыз аша кабул итү мөмкинме? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Вонг, CY, Әл-Сәләми, Х. һәм Дасс, КР. Диабетны дәвалау өчен инсулин белән тулыландырылган липосомаларны ораль рәвештә җибәрү системаларындагы соңгы казанышлар. Interpretation. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).