Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS ярдәме чикләнгән. Иң яхшы нәтиҗәләргә ирешү өчен, без сезгә браузерыгызның яңарак версиясен кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, даими ярдәм күрсәтү өчен, без сайтны стильләштермичә яки JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Пропион кислотасы (PPA) аутизм спектры бозылуы кебек нейроүсеш бозылуларында митохондриаль дисфункциянең ролен өйрәнү өчен кулланыла. PPA митохондриаль биогенезны, метаболизмны һәм әйләнешне боза дип билгеле. Ләкин, PPAның митохондриаль динамикага, бүленешкә һәм кушылуга йогынтысы бу механизмнарның катлаулы вакыт табигате аркасында проблемалы булып кала. Монда без PPAның нейронга охшаган SH-SY5Y күзәнәкләрендә митохондриаль ультструктурага, морфологиягә һәм динамикага ничек тәэсир итүен тикшерү өчен өстәмә санлы сурәтләү ысулларын кулланабыз. PPA (5 мМ) митохондриаль мәйданның (p < 0,01), Ферет диаметрының һәм әйләнәсенең (p < 0,05) һәм 2 нче мәйданның (p < 0,01) сизелерлек кимүенә китерде. Митохондриаль вакыйгалар локаторын анализлау бүленеш һәм кушылу вакыйгаларының сизелерлек артуын (p < 0,05) күрсәтте, шуның белән стресс шартларында митохондриаль челтәрнең бөтенлеген саклап калды. Моннан тыш, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) һәм OPA1 (p < 0.05) мРНК экспрессиясе сизелерлек кимеде. 01). Бу митохондриаль морфологиянең, биогенезның һәм динамиканың стресс шартларында функцияне саклап калу өчен яңадан модельләшүен күрсәтә. Безнең мәгълүматлар PPAның митохондриаль динамикага йогынтысына яңача күзаллау бирә һәм митохондриаль стресс җавапларында катнашкан катлаулы көйләү механизмнарын өйрәнү өчен визуализация ысулларының файдалылыгын күрсәтә.
Митохондрияләр энергия җитештерү һәм биосинтездагы гадәти рольләреннән тыш, төрле күзәнәк функцияләрендә аерылгысыз катнашучылар булып тора. Митохондрия метаболизмы кальций сигнализациясенең, метаболик һәм оксидлашу-кабызу гомеостазының, ялкынсыну сигнализациясенең, эпигенетик модификацияләрнең, күзәнәк пролиферациясенең, дифференциациясенең һәм программалаштырылган күзәнәк үлеменең төп регуляторы булып тора1. Аерым алганда, митохондрия метаболизмы нейроннар үсеше, яшәү һәм функция өчен бик мөһим һәм нейропатологиянең төрле күренешләрендә киң катнаша2,3,4.
Соңгы дистә ел эчендә метаболик статус нейрогенез, дифференциация, өлгерү һәм пластиклыкның үзәк регуляторы буларак барлыкка килде5,6. Соңгы вакытта митохондриаль морфология һәм динамика митозның аеруча мөһим компонентларына әйләнде, бу динамик процесс күзәнәкләр эчендә сәламәт митохондрияләр пулын саклый. Митохондриаль динамика митохондриаль биогенез һәм биоэнергетикадан алып митохондриаль бүленүгә, кушылуга, транспортка һәм чистартуга кадәр катлаулы үзара бәйле юллар белән көйләнә7,8. Бу интегратив механизмнарның теләсә кайсысының бозылуы сәламәт митохондриаль челтәрләрне саклауга комачаулый һәм нейроүсеш өчен тирән функциональ нәтиҗәләргә китерә9,10. Чыннан да, митохондриаль динамика дисрегуляциясе күп кенә психиатрик, нейродегенератив һәм нейроүсеш бозылуларында, шул исәптән аутизм спектры бозылуларында (ASD) күзәтелә11,12.
АСД - катлаулы генетик һәм эпигенетик архитектурасы булган гетероген нейроүсеш бозылуы. АСДның нәселдәнлеге бәхәссез, ләкин аның төп молекуляр этиологиясе әлегә кадәр начар аңлашылган. Клиникка кадәрге модельләрдән, клиник тикшеренүләрдән һәм күп омикслы молекуляр мәгълүматлар җыелмаларыннан тупланган мәгълүматлар ASD13,14 митохондриаль дисфункциясенең күбрәк дәлилләрен бирә. Элегрәк без АСД белән авыручылар когортасында геном буенча ДНК метилизациясе скринингын үткәрдек һәм митохондриаль метаболик юллар буйлап кластерлашкан дифференциаль метилизацияләнгән геннарны ачыкладык15. Соңрак без митохондриаль биогенез һәм динамиканың үзәк регуляторларының дифференциаль метилизациясе турында хәбәр иттек, бу ASD16 да мтДНК күчермәләре санының артуы һәм сидек метаболик профиленең үзгәрүе белән бәйле иде. Безнең мәгълүматлар митохондриаль динамиканың һәм гомеостазның АСД патофизиологиясендә үзәк роль уйнавын күрсәтә торган күбрәк дәлилләр бирә. Шуңа күрә, митохондриаль динамиканың, морфологиянең һәм функциянең бәйләнешен механик аңлауны яхшырту - икенчел митохондриаль дисфункция белән характерланган неврологик авыруларны өйрәнү буенча дәвам итүче тикшеренүләрнең төп максаты.
Молекуляр техникалар еш кына митохондриаль стресс реакцияләрендә билгеле бер геннарның ролен өйрәнү өчен кулланыла. Ләкин бу ысул митотик контроль механизмнарының күпкырлы һәм вакытлы табигате белән чикләнергә мөмкин. Моннан тыш, митохондриаль геннарның дифференциаль экспрессиясе функциональ үзгәрешләрнең туры булмаган күрсәткече булып тора, бигрәк тә гадәттә чикләнгән сандагы геннар гына анализлана. Шуңа күрә митохондриаль функцияне һәм биоэнергетиканы өйрәнү өчен турыдан-турырак ысуллар тәкъдим ителде17. Митохондриаль морфология митохондриаль динамика белән тыгыз бәйләнгән. Митохондриаль форма, бәйләнеш һәм структура энергия җитештерү һәм митохондриаль һәм күзәнәк яшәеше өчен бик мөһим5,18. Моннан тыш, митозның төрле компонентлары митохондриаль морфологиядәге үзгәрешләргә юнәлтелгән, алар митохондриаль дисфункциянең файдалы нокталары булып хезмәт итә ала һәм аннан соңгы механистик тикшеренүләр өчен нигез булып тора ала.
Митохондриаль морфологияне турыдан-туры трансмиссия электрон микроскопиясе (TEM) ярдәмендә күзәтергә мөмкин, бу күзәнәк ультрастурын җентекләп өйрәнергә мөмкинлек бирә. TEM митохондриаль кристалларның морфологиясен, формасын һәм структурасын аерым митохондрияләрнең чишелешендә турыдан-туры күзаллый, күзәнәк популяцияләрендә ген транскрипциясенә, аксым экспрессиясенә яки митохондриаль функциональ параметрларга гына таянмыйча17,19,20. Моннан тыш, TEM митохондрияләр һәм митохондриаль функциядә һәм гомеостазда төп роль уйный торган эндоплазматик челтәр һәм аутофагосомалар кебек башка органеллалар арасындагы үзара бәйләнешләрне өйрәнүне җиңеләйтә21,22. Шулай итеп, бу TEMны билгеле бер юлларга яки геннарга игътибар иткәнче митохондриаль дисфункцияне өйрәнү өчен яхшы башлангыч нокта итә. Митохондриаль функция нейропатология өчен барган саен актуальрәк була барган саен, митохондриаль морфологияне һәм динамиканы in vitro нейрон модельләрендә турыдан-туры һәм санлы рәвештә өйрәнү мөмкинлегенә ачык ихтыяҗ туа.
Бу мәкаләдә без аутизм спектры бозылуында митохондриаль дисфункциянең нейрон моделендә митохондриаль динамиканы тикшерәбез. Элегрәк без митохондриаль пропионил-КоА карбоксилаза ферменты PCC субберәмлеге булган ASD15'та пропионил-КоА карбоксилаза бета (PCCB) дифференциаль метиллашуы турында хәбәр иткән идек. PCC'ның бозылуы пропион кислотасы (PPA)23,24,25 кебек пропионил туындыларының токсик туплануына китерә дип билгеле. PPA нейрон метаболизмын боза һәм in vivo үз-үзен тотышын үзгәртә, һәм ASD26,27,28'да катнашкан нейроүсеш механизмнарын өйрәнү өчен билгеле хайван моделе булып тора. Моннан тыш, PPA'ның in vitro митохондриаль мембрана потенциалын, биогенезын һәм сулышын бозуы турында хәбәр ителә һәм нейроннарда митохондриаль дисфункцияне модельләштерү өчен киң кулланыла29,30. Ләкин, PPA китереп чыгарган митохондриаль дисфункциянең митохондриаль морфологиягә һәм динамикага йогынтысы әлегә кадәр аз аңлашылган.
Бу тикшеренүдә SH-SY5Y күзәнәкләрендә PPAның митохондриаль морфологиягә, динамикага һәм функциягә йогынтысын саннар белән билгеләү өчен өстәмә сурәтләү ысуллары кулланыла. Башта без митохондриаль морфология һәм ультратструктура үзгәрешләрен визуализацияләү өчен TEM ысулын эшләдек17,31,32. Митохондриальләрнең33 динамик табигатен исәпкә алып, без шулай ук ​​митохондриаль вакыйгалар локализаторы (MEL) анализын кулланып, PPA стрессы астында бүленү һәм кушылу вакыйгалары, митохондриаль саны һәм күләме арасындагы баланс үзгәрешләрен саннар белән билгеләдек. Ниһаять, без митохондриаль морфология һәм динамика биогенез, бүленү һәм кушылуда катнашкан геннар экспрессиясендәге үзгәрешләр белән бәйлеме-юкмы икәнен тикшердек. Бергәләп алганда, безнең мәгълүматлар митохондриаль динамиканы көйләүче механизмнарның катлаулылыгын ачыклау кыенлыгын күрсәтә. Без SH-SY5Y күзәнәкләрендә митохондриаль морфологияне өйрәнүдә TEMның файдалылыгын ассызыклыйбыз. Моннан тыш, без TEM мәгълүматларының метаболик стресска җавап итеп динамик вакыйгаларны да чагылдыра торган сурәтләү ысуллары белән берләштерелгәндә иң бай мәгълүмат бирүен ассызыклыйбыз. Нейрон күзәнәкләренең митозын тәэмин итүче молекуляр көйләү механизмнарын алга таба характерлау нерв системасының митохондриаль компоненты һәм нейродегенератив авырулар турында мөһим мәгълүмат бирә ала.
Митохондрия стрессын китереп чыгару өчен, SH-SY5Y күзәнәкләре 3 мМ һәм 5 мМ натрий пропионаты (NaP) кулланып PPA белән эшкәртелде. TEM алдыннан үрнәкләр югары басымлы туңдыру һәм туңдыру ярдәмендә криоген үрнәк әзерләүгә дучар ителде (1a рәсем). Без өч биологик кабатлау аша митохондрия популяцияләренең сигез морфологик параметрын үлчәү өчен автоматик митохондрия рәсем анализы үткәрдек. Без PPA белән эшкәртү дүрт параметрны сизелерлек үзгәрткәнен ачыкладык: 2 нче мәйдан, мәйдан, периметр һәм Ферет диаметры (1b–e рәсем). 2 нче мәйдан 3 мМ һәм 5 мМ PPA белән эшкәртү белән сизелерлек кимеде (p = 0,0183 һәм p = 0,002, тиешенчә) (1b рәсем), ә мәйдан (p = 0,003), периметр (p = 0,0106) һәм Ферет диаметры барысы да сизелерлек кимеде. Контроль төркем белән чагыштырганда, 5 мМ эшкәртү төркемендә сизелерлек кимү (p = 0,0172) күзәтелде (1c–e рәсем). Мәйдан һәм әйләнәнең сизелерлек кимүе 5 мМ PPA белән эшкәртелгән күзәнәкләрнең кечерәк, түгәрәкләнгәнрәк митохондрияләргә ия булуын һәм бу митохондрияләрнең контроль күзәнәкләрдәгегә караганда азрак озынрак булуын күрсәтте. Бу шулай ук ​​Ферет диаметрының сизелерлек кимүе белән туры килә, бу бәйсез параметр кисәкчәләр кырлары арасындагы иң зур араның кимүен күрсәтә. Кристаларның ультратөзелешендәге үзгәрешләр күзәтелде: PPA стрессы йогынтысында кристаллар азрак сизелә башлады (1а рәсем, B панеле). Ләкин, барлык рәсемнәр дә кристалларның ультратөзелешен ачык чагылдырмады, шуңа күрә бу үзгәрешләрнең санлы анализы үткәрелмәде. Бу TEM мәгълүматлары өч мөмкин булган сценарийны чагылдырырга мөмкин: (1) PPA бүленешне көчәйтә яки кушылуны тоткарлый, бу булган митохондрияләрнең зурлыгын киметә; (2) көчәйтелгән биогенез яңа, кечерәк митохондрияләр булдыра яки (3) ике механизмны да бер үк вакытта индукцияли. Бу шартларны TEM белән аерып булмаса да, морфологик үзгәрешләр PPA стрессы астында митохондрия гомеостазында һәм динамикасындагы үзгәрешләрне күрсәтә. Соңрак без бу динамиканы һәм аларның нигезендәге потенциаль механизмнарны тагын да характерлау өчен өстәмә параметрларны өйрәндек.
Пропион кислотасы (PPA) митохондрия морфологиясен үзгәртә. (a) PPA белән дәвалау артканда митохондрия зурлыгы кими һәм митохондрия кечерәя һәм түгәрәкләнә икәнен күрсәтүче репрезентатив трансмиссия электрон микроскопиясе (TEM) рәсемнәре; 0 мМ (дәваланмаган), 3 мМ һәм 5 мМ. Кызыл уклар митохондрияләрне күрсәтә. (b–e) 24 сәгать дәвамында PPA белән дәваланган SH-SY5Y күзәнәкләре TEM өчен әзерләнде һәм нәтиҗәләр Fiji/ImageJ ярдәмендә анализланды. Сигез параметрның дүртесе контроль (дәваланмаган, 0 мМ PPA) һәм дәваланган (3 мМ һәм 5 мМ PPA) күзәнәкләр арасында әһәмиятле аермалар күрсәтте. (b) 2 нче өлкә, (c) Мәйдан, (d) Периметр, (e) Ферет диаметры. Мөһим аермаларны билгеләү өчен дисперсиянең берьяклы анализы (контроль vs дәвалау) һәм Даннеттның күпсанлы чагыштыру тесты кулланылды (p < 0.05). Мәгълүмат нокталары һәр аерым күзәнәк өчен уртача митохондрия кыйммәтен күрсәтә, ә хата сызыклары уртача ± SEMны күрсәтә. Күрсәтелгән мәгълүматлар n = 3 ны күрсәтә, һәр кабатлауда ким дигәндә 24 күзәнәк; барлыгы 266 рәсем анализланган; * p < 0,05 не, ** p < 0,01 не күрсәтә.
Митохондрия динамикасы PPAга ничек җавап бирүен тагын да тирәнрәк характерлау өчен, без митохондрияләрне тетраметилродамин этил эфиры (TMRE) белән буядык һәм 3 һәм 5 мМ PPAда 24 сәгатьтән соң митохондрияләрне локализацияләү һәм санлаштыру өчен вакытлы микроскопия һәм MEL анализын кулландык. Бүленү һәм кушылу вакыйгаларын дәвалау. (2а рәсем). MEL анализыннан соң, митохондрияләр митохондрия структуралары санын һәм аларның уртача күләмен санлаштыру өчен өстәмә анализланды. Без 3 мМ [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] вакытында бүленү вакыйгалары санының кечкенә, ләкин сизелерлек артуын күзәттек, бүленү [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)) һәм кушылу [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] һәм кушылу [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05)] вакыйгалары контроль белән чагыштырганда 5 мМ да сизелерлек арткан (3б рәсем). Митохондрияләр саны 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] һәм 5 мМ [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] да сизелерлек арткан (3в рәсем), ә һәр митохондриаль структураның уртача күләме үзгәрешсез калган (3в рәсем). 3d). Бергәләп караганда, бу митохондриаль динамиканы яңадан модельләштерүнең митохондриаль челтәрнең бөтенлеген уңышлы саклый торган компенсатор җавап булып хезмәт итүен күрсәтә. 3 мМ PPA да бүленү вакыйгалары санының артуы митохондриаль санның артуы өлешчә митохондриаль бүленү аркасында булуын күрсәтә, ләкин митохондриаль уртача күләме нигездә үзгәрешсез калуын исәпкә алганда, биогенезны өстәмә компенсатор җавап буларак кире кагып булмый. Ләкин бу мәгълүматлар TEM күзәткән кечерәк, түгәрәк митохондриаль структуралар белән туры килә һәм шулай ук ​​PPA тарафыннан индукцияләнгән митохондриаль динамикадагы мөһим үзгәрешләрне күрсәтә.
Пропион кислотасы (PPA) челтәр бөтенлеген саклап калу өчен динамик митохондриаль ремоделизацияне стимуллаштыра. SH-SY5Y күзәнәкләре үстерелде, 24 сәгать дәвамында 3 һәм 5 мМ PPA белән эшкәртелде һәм TMRE һәм Hoechst 33342 белән буялды, аннары MEL анализы үткәрелде. (а) Һәр шарт өчен 2 нче вакытта (t2) төсле һәм икеләтелгән максималь интенсивлык проекцияләрен чагылдырган вакыт аралыгы микроскопиясе рәсемнәре. Һәр икеләтелгән рәсемдә күрсәтелгән сайланган өлкәләр вакыт узу белән динамиканы күрсәтү өчен өч төрле вакыт аралыгында (t1-t3) 3D форматында күрсәтелә һәм күрсәтелә; кушылу вакыйгалары яшел төс белән билгеләнгән; бүленү вакыйгалары яшел төс белән билгеләнгән. Кызыл төс белән күрсәтелгән. (б) Һәр шарт өчен динамик вакыйгаларның уртача саны. (в) Һәр күзәнәк өчен митохондриаль структураларның уртача саны. (г) Һәр күзәнәк өчен һәр митохондриаль структураның уртача күләме (µm3). Күрсәтелгән мәгълүматлар һәр дәвалау төркеме өчен n = 15 күзәнәкне күрсәтә. Күрсәтелгән хата юллары уртача ± SEMны күрсәтә, масштаб юллары = 10 μm, * p < 0.05.
Пропион кислотасы (PPA) митохондриаль динамика белән бәйле геннарның транскрипциясен бастыруга китерә. SH-SY5Y күзәнәкләре 24 сәгать дәвамында 3 һәм 5 мМ PPA белән эшкәртелде. Геннарны чагыштырмача санлаштыру RT-qPCR ярдәмендә башкарылды һәм B2M га нормальләштерелде. Митохондриаль биогенез геннары (а) cMYC, (б) TFAM, (в) NRF1 һәм (г) NFE2L2. Митохондриаль кушылу һәм бүленү геннары (д) STOML2, (ф) OPA1, (г) MFN1, (һ) MFN2 һәм (i) DRP1. Мөһим аермалар (p < 0,05) берьяклы ANOVA (контроль vs дәвалау) һәм Даннеттның күпсанлы чагыштыру тесты ярдәмендә тикшерелде: * p < 0,05, ** p < 0,01 һәм **** p < 0,0001 ны күрсәтә. Сызыклар уртача экспрессия ± SEM ны күрсәтә. Күрсәтелгән мәгълүматлар n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) һәм n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биологик кабатлауларны күрсәтә.
TEM һәм MEL анализларыннан алынган мәгълүматлар бергә PPA митохондрия морфологиясен һәм динамикасын үзгәртүен күрсәтә. Ләкин бу визуализация ысуллары бу процессларны хәрәкәткә китерүче төп механизмнар турында мәгълүмат бирми. Шуңа күрә без PPA дәвалавына җавап итеп митохондрия динамикасы, биогенез һәм митозның тугыз төп регуляторының мРНК экспрессиясен тикшердек. Без күзәнәк миелома онкогенын (cMYC), ядрә сулыш факторын (NRF1), митохондрия транскрипция факторын 1 (TFAM), NFE2-сыман транскрипция факторын BZIP (NFE2L2), гастринсыман аксым 2 (STOML2), күрү нервы атрофиясен 1 (OPA1), Митофусин 1 (MFN1), Митофусин 2 (MFN2) һәм динамин белән бәйле аксым 1 (DRP1) 24 сәгать 3 мМ һәм 5 мМ PPA белән дәвалаудан соң санлаштырдык. Без 3 мМ (p = 0.0053, p = 0.0415 һәм p < 0.0001, тиешенчә) һәм 5 мМ (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA белән дәвалауны күзәттек. (3a–c рәсем). мРНК экспрессиясенең кимүе дозага бәйле иде: cMYC, NRF1 һәм TFAM экспрессиясе 3 мМда тиешенчә 5.7, 2.6 һәм 1.9 тапкыр, ә 5 мМда 11.2, 3 һәм 2.2 тапкыр кимеде. Киресенчә, үзәк редокс биогенез гены NFE2L2 PPAның бернинди концентрациясендә дә үзгәрмәде, гәрчә экспрессиянең кимүенең охшаш дозага бәйле тенденциясе күзәтелде (3d рәсем).
Шулай ук ​​без бүленү һәм кушылуны көйләүдә катнашкан классик геннарның экспрессиясен тикшердек. STOML2 кушылуда, митофагиядә һәм биогенезда катнаша дип санала, һәм аның экспрессиясе 3 мМ (2,4 тапкыр үзгәрү) һәм 5 мМ (2,8 тапкыр үзгәрү) PPA белән сизелерлек кимегән (p < 0,0001) (1 нче рәсем). 3d). Шулай ук, OPA1 кушылу генының экспрессиясе 3 мМ (1,6 тапкыр үзгәрү) һәм 5 мМ (1,9 тапкыр үзгәрү) PPA белән кимегән (p = 0,006 һәм p = 0,0024, тиешенчә) (3f рәсем). Ләкин, без 24 сәгатьлек PPA стрессы астында кушылу геннары MFN1, MFN2 яки бүленү гены DRP1 экспрессиясендә сизелерлек аермалар тапмадык (3g–i рәсем). Моннан тыш, без дүрт кушылу һәм бүленү аксымнарының (OPA1, MFN1, MFN2 һәм DRP1) дәрәҗәләренең бер үк шартларда үзгәрмәвен ачыкладык (4a–d рәсем). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, бу мәгълүматлар вакытның бер ноктасын чагылдыра һәм PPA стрессының башлангыч стадияләрендә аксым экспрессиясендәге яки активлык дәрәҗәсендәге үзгәрешләрне чагылдырмаска мөмкин. Шулай да, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 һәм OPA1 экспрессиясенең сизелерлек кимүе митохондриаль метаболизмның, биогенезның һәм динамиканың транскрипция бозылуын күрсәтә. Моннан тыш, бу мәгълүматлар митохондриаль функциядәге соңгы халәт үзгәрешләрен турыдан-туры өйрәнү өчен визуализация ысулларының файдалылыгын күрсәтә.
Пропион кислотасы (PPA) белән эшкәртүдән соң кушылу һәм бүленү факторы аксым дәрәҗәләре үзгәрмәде. SH-SY5Y күзәнәкләре 24 сәгать дәвамында 3 һәм 5 мМ PPA белән эшкәртелде. Аксым дәрәҗәләре Вестерн-блот анализы ярдәмендә санлаштырылды, һәм экспрессия дәрәҗәләре гомуми аксымга нормальләштерелде. Уртача аксым экспрессиясе һәм максатчан һәм гомуми аксымның типик Вестерн-блотлары күрсәтелгән. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Сызыклар уртача ± SEMны күрсәтә, ә күрсәтелгән мәгълүматлар n = 3 биологик кабатлауларны күрсәтә. Күпсанлы чагыштырулар (p < 0,05) берьяклы дисперсия анализы һәм Даннетт тесты ярдәмендә башкарылды. Башлангыч гель һәм блот S1 рәсемендә күрсәтелгән.
Митохондриаль дисфункция метаболик, йөрәк-кан тамырлары һәм мускул авыруларыннан алып неврологик авыруларга кадәр күп системалы авырулар белән бәйле1,10. Күп кенә нейродегенератив һәм нейродегенератив авырулар митохондриаль дисфункция белән бәйле, бу минең гомере дәвамында бу органеллаларның мөһимлеген күрсәтә. Бу авыруларга Паркинсон авыруы, Альцгеймер авыруы һәм ASD керә3,4,18. Ләкин бу авыруларны өйрәнү өчен ми тукымасына керү авыр, бигрәк тә механик дәрәҗәдә, бу күзәнәк модель системаларын кирәкле альтернатива итә. Бу тикшеренүдә без нейрон авыруларында, аеруча аутизм спектры бозылуларында күзәтелгән митохондриаль дисфункцияне кабатлау өчен PPA белән эшкәртелгән SH-SY5Y күзәнәкләрен кулланып, күзәнәк модель системасын кулланабыз. Нейроннарда митохондриаль динамиканы өйрәнү өчен бу PPA моделен куллану ASD этиологиясен аңларга ярдәм итә ала.
Без митохондрия морфологиясендәге үзгәрешләрне күзәтү өчен ТЭМ куллану мөмкинлеген өйрәндек. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, аның нәтиҗәлелеген арттыру өчен ТЭМ дөрес кулланылырга тиеш. Крио-үрнәкләрне әзерләү бер үк вакытта күзәнәк компонентларын ныгыту һәм артефактлар барлыкка килүен киметү юлы белән нейрон структураларын яхшырак сакларга мөмкинлек бирә34. Моңа туры китереп, без нейронга охшаган SH-SY5Y күзәнәкләренең бөтен субклеткалы органеллалары һәм озынча митохондрияләре булуын күзәттек (1а рәсем). Бу нейрон күзәнәк модельләрендә митохондрия морфологиясен өйрәнү өчен криоген әзерләү ысулларының файдалылыгын күрсәтә. ТЭМ мәгълүматларын объектив анализлау өчен санлы үлчәүләр бик мөһим булса да, митохондрия морфологик үзгәрешләрен раслау өчен нинди конкрет параметрларны үлчәргә кирәклеге турында әлегә бердәм фикер юк. Митохондрия морфологиясен санлы рәвештә тикшергән күп санлы тикшеренүләргә нигезләнеп17,31,32, без сигез морфологик параметрны үлчәүче автоматлаштырылган митохондрия сурәт анализы конвейерын эшләдек, атап әйткәндә: мәйдан, мәйдан2, аспект нисбәте, периметр, түгәрәклек, дәрәҗә, Ферет диаметры. һәм түгәрәклек.
Алар арасында PPA 2 нче мәйданны, мәйданны, периметрны һәм Ферет диаметрын сизелерлек киметте (1b–e рәсем). Бу митохондрияләрнең кечерәюен һәм түгәрәкләнүен күрсәтте, бу PPA30 китереп чыгарган митохондрия стрессыннан соң 72 сәгатьтән соң митохондрия мәйданының кимүен күрсәткән элеккеге тикшеренүләр белән туры килә. Бу морфологик үзенчәлекләр митохондрия бүленүен күрсәтергә мөмкин, бу митохондрия челтәреннән зарарланган компонентларны митофагия аша деградацияләүне стимуллаштыру өчен кирәкле процесс35,36,37. Икенче яктан, митохондрияләрнең уртача зурлыгы кимү биогенезның артуы белән бәйле булырга мөмкин, бу кечкенә яңа барлыкка килгән митохондрияләр формалашуына китерә. Бүленү яки биогенезның артуы митохондрия стрессына каршы митозны саклап калу өчен компенсатор җавап булып тора. Ләкин митохондрия үсешенең кимүен, кушылуның бозылуын яки башка шартларны кире кагып булмый.
TEM ярдәмендә булдырылган югары сыйфатлы рәсемнәр аерым митохондрияләр дәрәҗәсендә морфологик үзенчәлекләрне билгеләргә мөмкинлек бирсә дә, бу ысул бер вакыт ноктасында ике үлчәмле фотолар ясый. Метаболик стресска динамик җавапларны өйрәнү өчен, без митохондрияләрне TMRE белән буядык һәм MEL анализы белән вакытлы микроскопия кулландык, бу вакыт узу белән митохондрия челтәрендәге үзгәрешләрне югары җитештерүчәнлекле 3D визуализацияләү мөмкинлеген бирә33,38. Без PPA стрессы астында митохондрия динамикасында нечкә, ләкин әһәмиятле үзгәрешләрне күзәттек (2 нче рәсем). 3 мМ да бүленү вакыйгалары саны сизелерлек артты, ә кушылу вакыйгалары контрольдәге кебек үк калды. 5 мМ PPA да бүленү һәм кушылу вакыйгалары санының артуы күзәтелде, ләкин бу үзгәрешләр якынча пропорциональ иде, бу бүленү һәм кушылу кинетикасының югарырак концентрацияләрдә тигезлеккә ирешүен күрсәтә (2б нче рәсем). Уртача митохондрия күләме 3 һәм 5 мМ PPA да үзгәрешсез калды, бу митохондрия челтәренең бөтенлеге сакланганлыгын күрсәтә (2г нче рәсем). Бу динамик митохондриаль челтәрләрнең җиңел метаболик стресска җавап биреп, челтәр фрагментациясенә китермичә гомеостазны нәтиҗәле саклап калу сәләтен чагылдыра. 3 мМ PPAда бүленешнең артуы яңа тигезлеккә күчүне стимуллаштыру өчен җитәрлек, ләкин PPAның югарырак концентрацияләре китереп чыгарган стресска җавап итеп тирәнрәк кинетик үзгәртеп кору кирәк.
Митохондрияләр саны ике PPA стресс концентрациясендә дә арткан, ләкин митохондриянең уртача күләме сизелерлек үзгәрмәгән (2в рәсем). Бу биогенезның артуы яки бүленешнең артуы белән бәйле булырга мөмкин; шулай да, митохондриянең уртача күләме сизелерлек киммәгән очракта, биосинтезның артуы ихтимал. Ләкин, 2 нче рәсемдәге мәгълүматлар ике компенсатор механизмның булуын раслый: митохондрия бүленешенең артуы белән туры килә торган бүленеш вакыйгалары санының артуы һәм митохондрия биогенезы белән туры килә торган вакыйгалар санының артуы. Ниһаять, җиңел стресс өчен динамик компенсация бүленеш, кушылу, биогенез һәм митофагия белән бәйле бер үк вакыттагы процесслардан торырга мөмкин. Элегрәк авторлар PPA митозны30,39 һәм митофагияне29 көчәйтә дип күрсәтсәләр дә, без PPAга җавап итеп митохондрия бүленеше һәм кушылу динамикасын яңадан модельләштерү өчен дәлилләр китерәбез. Бу мәгълүматлар TEM күзәткән морфологик үзгәрешләрне раслый һәм PPA китереп чыгарган митохондрия дисфункциясе белән бәйле механизмнар турында тулырак мәгълүмат бирә.
TEM да, MEL да анализлары күзәтелгән морфологик үзгәрешләрнең нигезендәге геннарны көйләү механизмнары турында турыдан-туры дәлилләр бирмәгәнлектән, без митохондриаль метаболизм, биогенез һәм динамика белән бәйле геннарның РНК экспрессиясен тикшердек. cMYC протоонкогены - митохондрия, гликолиз, аминокислоталар һәм май кислоталары метаболизмын көйләүдә катнашкан транскрипция факторы40. Моннан тыш, cMYC митохондриаль транскрипция, трансляция һәм комплекс җыюда катнашкан якынча 600 митохондриаль ген экспрессиясен көйли, шул исәптән NRF1 һәм TFAM41. NRF1 һәм TFAM - митозның ике үзәк регуляторы, алар PGC-1α агымында mtDNA репликациясен активлаштыру өчен эшлиләр. Бу юл cAMP һәм AMPK сигнализациясе белән активлаштырыла һәм энергия чыгымнарына һәм метаболик стресска сизгер. Без шулай ук ​​PPA йогынтысы оксидлашу стрессы белән бәйле булырга мөмкинме-юкмы икәнен билгеләү өчен митохондриаль биогенезның редокс регуляторы NFE2L2 ны тикшердек.
NFE2L2 экспрессиясе үзгәрешсез калса да, без 3 мМ һәм 5 мМ PPA белән 24 сәгатьлек дәвалаудан соң cMYC, NRF1 һәм TFAM экспрессиясенең дозага бәйле кимүен ачыкладык (3a–c рәсем). cMYC экспрессиясенең кимүе элек митохондриаль стресска җавап буларак хәбәр ителгән иде42, һәм киресенчә, cMYC экспрессиясенең кимүе митохондриаль метаболизмны, челтәр тоташуын һәм мембрана поляризациясен үзгәртеп, митохондриаль дисфункциягә китерергә мөмкин43. Кызыклысы шунда ки, cMYC шулай ук ​​митохондриаль бүленү һәм кушылуны көйләүдә катнаша42,43 һәм күзәнәк бүленеше вакытында DRP1 фосфорлашуын һәм митохондриаль локализацияне арттыра44, шулай ук ​​нейрон күзәнәкләрендә митохондриаль морфологик үзгәртеп коруда арадашчылык итә45. Чыннан да, cMYC җитмәгән фибробластлар митохондриаль зурлыкның кимүен күрсәтә, бу PPA43 стрессы белән китереп чыгарылган үзгәрешләргә туры килә. Бу мәгълүматлар cMYC һәм митохондриаль динамика арасындагы кызыклы, ләкин әлегә ачык булмаган бәйләнешне күрсәтә, бу PPA стрессы китереп чыгарган ремоделизацияне киләчәктә өйрәнү өчен кызыклы максат булып тора.
NRF1 һәм TFAM кимүе cMYC-ның мөһим транскрипция активаторы роленә туры килә. Бу мәгълүматлар шулай ук ​​кеше юан эчәге яман шеш күзәнәкләрендә үткәрелгән элеккеге тикшеренүләр белән дә туры килә, алар PPA-ның 22 сәгать эчендә NRF1 мРНК экспрессиясен киметүен күрсәтә, бу АТФ кимүе һәм ROS46 артуы белән бәйле. Бу авторлар шулай ук ​​TFAM экспрессиясенең 8,5 сәгатьтә артуын, ләкин 22 сәгатьтән башлангыч дәрәҗәгә кайтуын хәбәр иттеләр. Киресенчә, Ким һ.б. (2019) SH-SY5Y күзәнәкләрендә 4 сәгатьлек PPA стрессыннан соң TFAM мРНК экспрессиясенең сизелерлек кимегәнен күрсәттеләр; ләкин, 72 сәгатьтән соң TFAM аксымы экспрессиясе сизелерлек артты һәм мтДНК күчермәсе саны сизелерлек артты. Шулай итеп, 24 сәгатьтән соң күзәтелгән митохондриаль биогенез геннары санының кимүе митохондрияләр саны артуның биогенезның иртәрәк вакыт нокталарында активлашуы белән бәйле булуын кире какмый. Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр күрсәткәнчә, PPA 4 сәгать 30 минутта SH-SY5Y күзәнәкләрендә PGC-1α мРНКсын һәм аксымын сизелерлек арттыра, ә пропион кислотасы 12 сәгать 39 минутта PGC-1α аша бозау гепатоцитларында митохондриаль биогенезны көчәйтә. Кызыклысы шунда ки, PGC-1α NRF1 һәм TFAMның турыдан-туры транскрипция регуляторы гына түгел, ә бүленү һәм кушылуны көйләү юлы белән MFN2 һәм DRP1 активлыгын да көйли47. Бергәләп караганда, бу PPA тарафыннан индукцияләнгән митохондриаль компенсатор җавапларны көйләү механизмнарының тыгыз бәйләнешен күрсәтә. Моннан тыш, безнең мәгълүматлар PPA стрессы астында биогенез һәм метаболизмның транскрипция регуляторының сизелерлек бозылуын чагылдыра.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 һәм DRP1 геннары митохондриаль бүленеш, кушылу һәм динамиканың үзәк регуляторлары арасында 37,48,49. Митохондриаль динамикага башка күп геннар да керә, ләкин STOML2, OPA1 һәм MFN2 элегрәк ASD когорталарында төрлечә метилләштерелгән дип табылган, 16 һәм берничә бәйсез тикшеренүдә митохондриаль стресска җавап итеп бу транскрипция факторларында үзгәрешләр турында хәбәр ителгән 50,51. 52. OPA1 һәм STOML2 экспрессиясе 3 мМ һәм 5 мМ PPA белән дәвалау белән сизелерлек кимегән (3e, f рәсем). OPA1 - MFN1 һәм 2 белән турыдан-туры үзара бәйләнеш аша митохондриаль кушылуның классик регуляторларының берсе һәм кристалларның ремоделингында һәм митохондриаль морфологиядә роль уйный 53. STOML2-ның митохондриаль динамикадагы төгәл роле әлегә ачык түгел, ләкин дәлилләр аның митохондриаль кушылуда, биогенезда һәм митофагиядә роль уйнавын күрсәтә.
STOML2 митохондрия сулыш алу бәйләнешен саклауда һәм сулыш алу чылбыры комплексларын формалаштыруда катнаша54,55 һәм яман шеш күзәнәкләренең метаболик үзенчәлекләрен тирәнтен үзгәртүе күрсәтелгән56. Тикшеренүләр күрсәткәнчә, STOML2 BAN һәм кардиолипин белән үзара бәйләнеш аша митохондрия мембранасы потенциалын һәм биогенезын стимуллаштыра55, 57, 58. Моннан тыш, бәйсез тикшеренүләр STOML2 һәм PINK1 арасындагы үзара бәйләнеш митофагияне көйли59,60. Шунысы игътибарга лаек, STOML2 MFN2 белән турыдан-туры үзара бәйләнештә булуы һәм аны тотрыклыландыруы турында хәбәр ителгән, шулай ук ​​OPA1 деградациясе өчен җаваплы протеазаны тоткарлау юлы белән озын OPA1 изоформаларын тотрыклыландыруда мөһим роль уйный53,61,62. PPA реакцияләрендә күзәтелгән STOML2 экспрессиясенең кимүе бу кушылу аксымнарын убиквитин һәм протеасомага бәйле юллар аша деградациягә бирешүчәнрәк итәргә мөмкин48. STOML2 һәм OPA1-нең PPA-га динамик җавап бирүдәге төгәл роле ачык булмаса да, бу кушылу геннарының экспрессиясе кимүе (3 нче рәсем) бүленү һәм кушылу арасындагы балансны бозарга һәм митохондрия зурлыгының кимүенә китерергә мөмкин (3 нче рәсем). 1).
Икенче яктан, OPA1 аксымының экспрессиясе 24 сәгатьтән соң үзгәрешсез калды, ә MFN1, MFN2 яки DRP1 мРНК һәм аксым дәрәҗәләре PPA белән дәвалаудан соң сизелерлек үзгәрмәде (3g-i рәсем, 4 нче рәсем). Бу митохондриаль кушылу һәм бүленүдә катнашкан бу факторларның көйләнешендә үзгәрешләр булмавын күрсәтергә мөмкин. Шулай да, бу дүрт генның һәрберсенең аксым активлыгын контрольдә тотучы посттранскрипцион модификацияләр (PTM) белән дә көйләнүен билгеләп үтәргә кирәк. OPA1ның митохондриаль кушылуда протеолитик яктан бүленгән сигез альтернатив сплайс варианты бар 63. Озын һәм кыска изоформалар арасындагы баланс, нәтиҗәдә, OPA1ның митохондриаль кушылуда һәм митохондриаль челтәрне саклап калуда ролен билгели64. DRP1 активлыгы кальций/кальмодулинга бәйле аксым киназа II (CaMKII) фосфорлануы белән көйләнә, ә DRP1 деградациясе убиквитинация һәм SUMOylash белән көйләнә65. Ниһаять, DRP1 һәм MFN1/2 икесе дә GTPазалар, шуңа күрә активлыкка митохондрияләрдә GTP җитештерү тизлеге тәэсир итәргә мөмкин 66. Шуңа күрә, бу аксымнарның экспрессиясе даими булып калса да, бу үзгәрмәгән аксым активлыгын яки локализацияне чагылдырмаска мөмкин 67,68. Чыннан да, булган PTM аксым репертуарлары еш кына кискен стресс җавапларын җайга салу өчен җаваплы беренче саклану линиясе булып хезмәт итә. Безнең модельдә уртача метаболик стресс булганда, PTM кушылу һәм бүленү аксымнарының активлыгын арттырып, митохондрия бөтенлеген мРНК яки аксым дәрәҗәсендә өстәмә активлаштыруны таләп итмичә торгызырга ярдәм итә.
Бергәләп караганда, югарыдагы мәгълүматлар митохондриаль морфологиянең катлаулы һәм вакытка бәйле көйләнешен һәм бу механизмнарны ачыклаудагы кыенлыкларны күрсәтә. Ген экспрессиясен өйрәнү өчен, башта юлдагы билгеле бер максатлы геннарны ачыкларга кирәк. Ләкин, безнең мәгълүматлар бер үк юлдагы геннарның бер үк стресска бер үкчә җавап бирмәвен күрсәтә. Чынлыкта, алдагы тикшеренүләр бер үк юлдагы төрле геннарның төрле вакытлы җавап профильләрен күрсәтергә мөмкинлеген күрсәтте30,46. Моннан тыш, транскрипция һәм ген функциясе арасындагы бәйләнешне боза торган катлаулы посттранскрипцион механизмнар бар. Протеомик тикшеренүләр PTM һәм аксым функциясенең йогынтысын аңларга ярдәм итә ала, ләкин алар шулай ук ​​түбән үткәрүчәнлекле ысуллар, югары сигнал-шау нисбәте һәм начар чишелеш кебек кыенлыклар тудыра.
Бу контекстта, TEM һәм MEL кулланып митохондриаль морфологияне өйрәнү митохондриаль динамикасы һәм функциясе арасындагы бәйләнеш һәм моның авыруларга ничек тәэсир итүе турындагы фундаменталь сорауларга җавап бирү өчен зур потенциалга ия. Иң мөһиме, TEM митохондриаль дисфункция һәм динамикасының конвергент оч ноктасы буларак митохондриаль морфологияне үлчәү өчен турыдан-туры ысул тәкъдим итә51. MEL шулай ук ​​өч үлчәмле күзәнәк мохитендә бүленү һәм кушылу вакыйгаларын визуализацияләү өчен турыдан-туры ысул тәкъдим итә, ген экспрессиясендә үзгәрешләр булмаганда да динамик митохондриаль ремоделизацияне санлаштыру мөмкинлеге бирә33. Монда без икенчел митохондриаль авыруларда митохондриаль сурәтләү ысулларының файдалылыгын ассызыклыйбыз. Бу авырулар гадәттә митохондриаль челтәрләрнең кискен зыяны түгел, ә нечкә ремоделизациясе белән характерлана торган хроник җиңел метаболик стресс белән характерлана. Ләкин, хроник стресс астында митозны саклап калу өчен кирәкле митохондриаль компенсация тирән функциональ нәтиҗәләргә китерә. Нейрология контекстында, бу компенсатор механизмнарны яхшырак аңлау митохондриаль дисфункция белән бәйле плейотроп нейропатология турында мөһим мәгълүмат бирә ала.
Ниһаять, безнең мәгълүматлар ген экспрессиясе, аксым модификацияләре һәм нейрон митохондриаль динамикасын контрольдә тотучы аксым активлыгы арасындагы катлаулы үзара бәйләнешләрнең функциональ нәтиҗәләрен аңлау өчен сурәтләү ысулларының файдалылыгын күрсәтә. Без ASD митохондриаль компонентын аңлау өчен нейрон күзәнәге моделендә митохондриаль дисфункцияне модельләштерү өчен PPA кулландык. PPA белән дәваланган SH-SY5Y күзәнәкләре митохондриаль морфологиядә үзгәрешләр күрсәттеләр: митохондрияләр кечкенә һәм түгәрәк формага килделәр, ә TEM ярдәмендә күзәтелгәндә кристаллар начар билгеләнде. MEL анализы күрсәткәнчә, бу үзгәрешләр җиңел метаболик стресска җавап итеп митохондриаль челтәрне саклап калу өчен бүленү һәм кушылу вакыйгалары арту белән бер үк вакытта була. Моннан тыш, PPA митохондриаль метаболизм һәм гомеостазның транскрипция көйләүен сизелерлек боза. Без cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 һәм OPA1 ны PPA стрессы белән бозылган төп митохондриаль регуляторлар дип билгеләдек һәм митохондриаль морфология һәм функциядә PPA китереп чыгарган үзгәрешләрне арадашчылык итүдә роль уйнарга мөмкин. Ген экспрессиясендә һәм аксым активлыгында, локализациядә һәм трансляциядән соңгы модификацияләрдә PPA китереп чыгарган вакыт үзгәрешләрен яхшырак характерлау өчен киләчәк тикшеренүләр кирәк. Безнең мәгълүматлар митохондриаль стресс җавабын җайга салучы көйләү механизмнарының катлаулылыгын һәм үзара бәйләнешен күрсәтә һәм максатчанрак механистик тикшеренүләр өчен ТЭМ һәм башка визуализация ысулларының файдалылыгын күрсәтә.
SH-SY5Y күзәнәк линиясе (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich компаниясеннән сатып алынган. SH-SY5Y күзәнәкләре Dulbecco'ның модификацияләнгән Eagle's мохит/F-12 туклыклы катнашмасында (DMEM/F-12) һәм L-глутамин (SC09411, ScienCell) 25 см2 колбаларда 20% феталь сыер сывороткасы (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) һәм 1% пенициллин-стрептомицин (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) белән тулыландырылган, 37 °C температурада, 5% CO2 температурада үстерелгән. Күзәнәкләр 0,05% трипсин-ЭДТА (15400054, ThermoFisher Scientific) кулланып 80% кушылганчы субкультураланды, 300 г центрифугаланды һәм якынча 7 × 105 күзәнәк/мл тыгызлыгында пластина белән капланды. Барлык тәҗрибәләр дә 19–22 нче юллар арасындагы дифференциацияләнмәгән SH-SY5Y күзәнәкләрендә үткәрелде. PPA NaP рәвешендә бирелә. NaP порошогын (CAS № 137-40-6, химик формуласы C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) җылы MilliQ суда 1 М концентрациясенә кадәр эретегез һәм 4 °C температурада саклагыз. Дәвалау көнендә бу эремәне 1 М PPA белән 3 мМ һәм 5 мМ PPA белән сывороткасыз мохиттә (DMEM/F-12 белән L-глутамин) суюлтыгыз. Барлык экспериментлар өчен дәвалау концентрацияләре PPA (0 мМ, контроль), 3 мМ һәм 5 мМ PPA булды. Экспериментлар ким дигәндә өч биологик кабатлауда үткәрелде.
SH-SY5Y күзәнәкләре 25 см5 колбаларга 5,5 × 105 күзәнәк/мл тизлегендә чәчелде һәм 24 сәгать үстерелде. PPA белән эшкәртү колбага 24 сәгать инкубация алдыннан өстәлде. Күзәнәк гранулаларын гадәти имезүчеләр тукымалары субкультурасы протоколларына туры китереп җыегыз (югарыда тасвирланган). Күзәнәк грануласын 100 мкл 2,5% глутаральдегид, 1× PBS эремәсендә кабат эретегез һәм эшкәртелгәнче 4°C температурада саклагыз. SH-SY5Y күзәнәкләре күзәнәкләрне эретмәк һәм 2,5% глутаральдегид, 1× PBS эремәсен алу өчен кыска вакытка центрифугаланды. Утырманы дистилляцияләнгән суда әзерләнгән 4% агароза гелендә кабат эретегез (агарозаның утырма күләменә нисбәте 1:1). Агароза кисәкләре яссы пластиналардагы челтәрләргә урнаштырылды һәм югары басымлы туңдыру алдыннан 1-гексадецен белән капланды. Үрнәкләр 100% коры ацетонда -90°C температурада 24 сәгать туңдырылды. Аннары температура -80°C кадәр күтәрелде һәм 1% осмий тетроксиды һәм 0,1% глутаральдегид эремәсе өстәлде. Үрнәкләр -80°C температурада 24 сәгать сакланды. Шуннан соң, температура берничә көн дәвамында әкренләп бүлмә температурасына кадәр күтәрелде: 24 сәгать дәвамында – 80°C тан – 50°C га кадәр, 24 сәгать дәвамында – 30°C га кадәр, 24 сәгать дәвамында – 10°C га кадәр һәм, ниһаять, бүлмә температурасына кадәр.
Криоген әзерлектән соң, үрнәкләр смола белән эшкәртелде һәм Leica Reichert UltracutS ультрамикротомы (Leica Microsystems) ярдәмендә ультранечкә кисемтәләр (∼100 нм) ясалды. Кисемтәләр 2% уранил ацетат һәм кургаш цитраты белән буялды. Үрнәкләр 200 кВ көчәнештә эшли торган FEI Tecnai 20 трансмиссия электрон микроскобы (ThermoFisher (элеккеге FEI), Эйндховен, Нидерландлар) (Lab6 трансмиссиясе) һәм Tridiem энергия фильтры белән җиһазландырылган Gatan CCD камерасы (Gatan, Бөекбритания) ярдәмендә күзәтелде.
Һәр техник кабатлауда ким дигәндә 24 бер күзәнәкле рәсем алынган, барлыгы 266 рәсем. Барлык рәсемнәр дә Кызыксыну өлкәсе (ROI) макросы һәм Митохондрия макросы ярдәмендә анализланган. Митохондрия макросы бастырылган ысулларга нигезләнгән17,31,32 һәм Fiji/ImageJ69да TEM рәсемнәрен ярым автоматик рәвештә төркемләп эшкәртү мөмкинлеген бирә. Кыскасы: рәсем әйләндерелгән шар фонын алу (60 пиксель радиусы) һәм FFT полосалы фильтр (тиешенчә 60 һәм 8 пиксель югары һәм түбән чикләр кулланып) һәм 5% юнәлеш толерантлыгы белән вертикаль сызыкны бастыру ярдәмендә кирегә әйләндерелә һәм кирегә әйләндерелә. Эшкәртелгән рәсем максималь энтропия алгоритмы ярдәмендә автоматик рәвештә чикләнә һәм икеле битлек барлыкка килә. Чимал TEM рәсемнәрендә кул белән сайланган ROI белән бәйле рәсем өлкәләре алынган, митохондрияләрне характерлый һәм плазма мембранасын һәм башка югары контрастлы өлкәләрне чыгарып ташлаган. Һәр алынган ROI өчен 600 пиксельдән зуррак бинар кисәкчәләр анализланды, һәм кисәкчәләр мәйданы, периметры, зур һәм кече күчәрләр, Ферет диаметры, түгәрәклеге һәм әйләнәлеге Fiji/ImageJ'ның урнаштырылган үлчәү функцияләре ярдәмендә үлчәнде. Merrill, Flippo һәм Strack (2017) буенча, бу мәгълүматлардан 2 нче мәйдан, кисәкчәләрнең аспект нисбәте (зурдан кече күчәргә нисбәте) һәм форма факторы (FF) исәпләнде, монда FF = периметр 2/4pi x мәйдан. Параметрик формуланың билгеләмәсен Merrill, Flippo һәм Strack (2017)'та табарга мөмкин. Искә алынган макрослар GitHub'та бар (Мәгълүматларның булуы турындагы белдерүне карагыз). Уртача алганда, PPA эшкәртүендә якынча 5600 кисәкчә анализланды, барлыгы якынча 17000 кисәкчә (мәгълүмат күрсәтелмәгән).
SH-SH5Y күзәнәкләре төнлә адгезияне тәэмин итү өчен 8 камералы культура савытларына (ThermoFisher, #155411) урнаштырылды, аннары TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) һәм Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) белән буяу белән инкубацияләнде. Рәсемнәр 10 минутлык мохиттә 405 нм һәм 561 нм лазерлар ярдәмендә алынды, ә чимал рәсемнәр 12 вакыт ноктасында рәсем кадрлары арасында 0,2 мкм аз адымлы 10 рәсем микрографын үз эченә алган z-стеклар рәвешендә алынды. Рәсемнәр Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 супер-чишелешле платформасы (Carl Zeiss, Oberkochen, Германия) ярдәмендә LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 объективын кулланып җыелды. Рәсемнәр ImageJ программасында элек тасвирланган конвейер һәм ImageJ плагины ярдәмендә анализланды, шуның белән кушылу һәм бүленү вакыйгаларын, митохондриаль структураларның уртача санын һәм күзәнәккә уртача митохондриаль күләмне үлчәделәр33. MEL макрослары GitHub'та бар (Мәгълүматларның булуы турындагы белдерүне карагыз).
SH-SY5Y күзәнәкләре алты чокырлы пластиналарда 0,3 × 106 күзәнәк/мл тыгызлыгында эшкәртү алдыннан 24 сәгать дәвамында үстерелде. РНК Quick-RNA™ Miniprep протоколы (ZR R1055, Zymo Research) ярдәмендә бераз үзгәрешләр белән алынды: алу алдыннан һәр чокырда 300 мкл РНК лизис буферы өстәгез һәм һәр үрнәкне соңгы адым буларак 30 мкл DNase/RNase элюциясе белән лизислагыз. -сыз су. Барлык үрнәкләр дә NanoDrop ND-1000 UV-Vis спектрофотометры ярдәмендә сан һәм сыйфат буенча тикшерелде. Күзәнәк лизатларыннан гомуми аксым 200 мкл RIPA лизис буферы ярдәмендә алынды, ә аксым концентрациясе Bradford аксым анализы ярдәмендә санлаштырылды70.
кДНК синтезы җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, кайбер үзгәрешләр кертелгән Tetro™ кДНК синтез комплекты (BIO-65043, Meridian Bioscience) ярдәмендә башкарылды. кДНК 20 мкл реакцияләрдә 0,7 дән 1 мкг га кадәр гомуми РНК кулланып синтезланды. Праймерлар элек бастырылган 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 мәкаләләреннән (S1 таблицасы) сайланды һәм аңа ияреп баручы зондлар Integrated DNA Technologies компаниясенең PrimerQuest коралы ярдәмендә эшләнде. Кызыксындырган барлык геннар да B2M генына нормальләштерелде. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC һәм OPA1 геннарының экспрессиясе RT-qPCR ярдәмендә үлчәнде. Мастер-микс составына LUNA Taq полимеразасы (M3003L, New England Biolabs), 10 мкМ алга һәм кире праймерлар, кДНК һәм ПЦР дәрәҗәсендәге су керде, һәр реакция өчен 10 мкл соңгы күләм алынды. Бүленү һәм бүленү геннарының экспрессиясе (DRP1, MFN1/2) TaqMan мультиплекс анализлары ярдәмендә үлчәнде. Luna Universal Probe qPCR Мастер-миксы (M3004S, New England Biolabs) җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп, кечкенә үзгәрешләр белән кулланылды. Мультиплекс RT-qPCR мастер-миксы составына 1X LUNA Taq полимеразасы, 10 мкМ алга һәм кире праймерлар, 10 мкМ зонд, кДНК һәм ПЦР дәрәҗәсендәге су керә, нәтиҗәдә һәр реакция өчен 20 мкл соңгы күләм алынды. RT-qPCR Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—серия номеры: R0618110) ярдәмендә башкарылды. Цикл шартлары S1 таблицасында күрсәтелгән. Барлык кДНК үрнәкләре өч тапкыр көчәйтелде һәм ун тапкыр суюлту сериясе ярдәмендә стандарт кәкре формалаштырылды. Цикл бусагасы стандарт тайпылышы (Ct) >0,5 булган өч тапкыр үрнәкләрдәге читләштерелгән нокталар мәгълүматларның кабатланучанлыгын тәэмин итү өчен анализдан алынды30,72. Чагыштырма ген экспрессиясе 2-ΔΔCt79 ысулы ярдәмендә исәпләнде.
Аксым үрнәкләре (60 мкг) Laemmli йөкләү буферы белән 2:1 нисбәтендә кушылды һәм 12% төссез аксым геле (Bio-Rad #1610184) өстендә эшләтелде. Аксымнар Trans-Blot Turbo системасы (#170-4155, Bio-Rad) ярдәмендә PVDF (поливинилиден фториды) мембранасына (#170-84156, Bio-Rad) күчерелде. Мембрана блокланды һәм тиешле беренчел антитәнчекләр (OPA1, MFN1, MFN2 һәм DRP1) белән 48 сәгать дәвамында инкубацияләнде (1:1000 сыекландырылды), аннары икенчел антитәнчекләр белән (1:10,000) 1 сәгать инкубацияләнде. Аннары мембраналар Clarity Western ECL субстраты (#170-5061, Bio-Rad) ярдәмендә сурәтләнде һәм Bio-Rad ChemiDoc MP системасы ярдәмендә яздырылды. Western blot анализы өчен ImageLab 6.1 версиясе кулланылды. Башлангыч гель һәм блот S1 рәсемендә күрсәтелгән. Антителалар турында мәгълүмат S2 таблицасында бирелгән.
Мәгълүмат җыелмалары кимендә өч бәйсез үрнәкнең уртача кыйммәте һәм стандарт хатасы (SEM) буларак күрсәтелә. Мәгълүмат җыелмалары Гаусс бүленешен һәм тигез стандарт тайпылышларны фаразлаганчы һәм анализларны дәвам иткәнче, Шапиро-Вилкс тесты ярдәмендә нормальлеккә тикшерелде (башкача күрсәтелмәгән очракта). Мәгълүмат җыелмасын анализлаудан тыш, Фишерның MEL LSD (p < 0,05), берьяклы ANOVA (дәвалауга каршы контроль уртача) һәм Даннеттның күп чагыштыру тесты ярдәмендә әһәмиятлелекне билгеләү өчен (p < 0,05). Мөһим p кыйммәтләре графикта *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 буларак күрсәтелгән. Барлык статистик анализлар һәм графиклар GraphPad Prism 9.4.0 ярдәмендә башкарылды һәм булдырылды.
TEM рәсем анализы өчен Fiji/ImageJ макрослары GitHub'та ачык: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Митохондриаль вакыйгалар локаторы (MEL) макросы GitHub'та ачык: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви Н.М. һәм Виджая А. Митохондрияләр: метаболизм, гомеостаз, стресс, картаю һәм эпигенетиканың төп регуляторлары. Индонезия. Биомедицина фәне. J. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Шизофрениядә күпкырлы митохондриаль дисфункция, I комплекс патологик максат буларак. Шизофрения. чыганак. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. һәм Бил, М.Ф. Паркинсон авыруында митохондриаль дисфункция. Нейрохимия журналы. 139, 216–231 (2016).
Шарма В.К., Сингх Т.Г. һәм Мехта В. Стресслы митохондрияләр: Альцгеймер авыруында инвазия максатлары. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Беленгуэр П., Дуарте Дж.М.Н., Шук П.Ф. һәм Феррейра Г.К. Митохондрияләр һәм баш мие: биоэнергетика һәм башкалар. Нейротоксиннар. ресурс. 36, 219–238 (2019).
Рангаражу, В. һ.б. Плейотроп митохондрияләр: митохондрияләрнең нейрон үсешенә һәм авыруларына йогынтысы. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardano-Ramos, C. һәм Morais, VA Нейроннарда митохондриаль биогенез: ничек һәм кайда. халыкаралык. J. Mor. фән. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендаль, У., Нистер, М. һәм Чжао, Дж. Имезүчеләрнең митохондриаль динамикасын көйләү: мөмкинлекләр һәм кыенлыклар. фронт. эндокрин. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. һәм Слэк, РС Нейрогенезны көйләүдә митохондриаль динамика: үсеп килүчедән алып олыларга кадәр. үсеш. динамик. 247, 47–53 (2018).