Хәзерге вакытта *Хәзерге адрес: Кёльн 50931, Германия, Картаю белән бәйле авыруларда күзәнәк стрессына җавап бирү буенча Кёльнның алдынгы кластер тикшеренүе (CECAD).
Митохондриаль авыруларның нейродегенерациясе кире кайтарып булмый торган дип санала, чөнки нейроннарның метаболик пластиклыгы чикләнгән, ләкин митохондриаль дисфункциянең организмдагы нейрон метаболизмының күзәнәк автономиясенә йогынтысы начар аңлашылган. Монда без митохондриаль кушылу динамикасы бозылганнан килеп чыккан прогрессив OXPHOS җитмәүчәнлеге булган Пуркинье нейроннарының күзәнәккә хас протеомын тәкъдим итәбез. Без митохондриаль дисфункциянең протеомика өлкәсендә тирән үзгәрешләргә китергәнен ачыкладык, бу нәтиҗәдә күзәнәк үлеме алдыннан төгәл метаболик программаларның эзлекле активлашуына китерде. Көтелмәгән рәвештә, без пируват карбоксилаза (PCx) һәм TCA циклының арадаш продуктларын тулыландыра торган башка картаюга каршы ферментларның ачык индукциясен билгеләдек. PCx ингибирлавы оксидатив стрессны һәм нейродегенерацияне көчәйтте, бу атеросклерозның OXPHOS җитмәгән нейроннарда саклагыч йогынты ясавын күрсәтә. Терминаль дегенерацияләнгән нейроннарда митохондриаль кушылуны торгызу бу метаболик үзенчәлекләрне тулысынча кире кайтара, шуның белән күзәнәк үлемен булдырмый. Безнең ачышлар митохондриаль дисфункциягә чыдамлык бирә торган элек билгесез юлларны ачыклый һәм нейродегенерациянең хәтта авыруның соңгы стадияләрендә дә кире кайтарылып булачагын күрсәтә.
Митохондрияләрнең нейрон энергиясе метаболизмын саклаудагы төп роле кеше митохондрия авырулары белән бәйле киң неврологик симптомнар белән ассызыклана. Бу авыруларның күбесе митохондрия геннары экспрессиясен көйләүче ген мутацияләре (1, 2) яки митохондрия динамикасына бәйле геннарның җимерелүе аркасында килеп чыга, алар митохондрия ДНКсының (мтДНК) тотрыклылыгына турыдан-туры йогынты ясый (3, 4). Хайван модельләрендәге эшләр күрсәткәнчә, тирә-юньдәге тукымаларда митохондрия дисфункциясенә җавап итеп, консерватив метаболик юллар (5-7) активлаштырылырга мөмкин, бу бу катлаулы авыруларның патогенезын тирәнтен аңлау өчен мөһим мәгълүмат бирә. Киресенчә, ми митохондрия аденозин трифосфаты (АТФ) җитештерүнең гомуми җитешсезлеге аркасында килеп чыккан билгеле бер күзәнәк төрләренең метаболик үзгәрешләрен аңлавыбыз төп фактор булып тора (8), бу авыруларны булдырмау яки кисәтү өчен кулланылырга мөмкин булган терапевтик максатларны билгеләү кирәклеген ассызыклый. Нейродегенерацияне булдырмаска (9). Мәгълүмат җитмәү - нерв күзәнәкләренең тирә-юньдәге тукымаларның күзәнәк төрләре белән чагыштырганда метаболик сыгылучанлыгы бик чикләнгән дип саналуы (10). Бу күзәнәкләр нейроннарга метаболитлар белән тәэмин итүне координацияләүдә үзәк роль уйнавын исәпкә алып, синаптик тапшыруны стимуллаштыру һәм җәрәхәтләргә һәм авыру шартларына җавап бирү өчен, күзәнәк метаболизмын ми тукымасының катлаулы шартларына җайлаштыру сәләте глиаль күзәнәкләр белән чикләнгән диярлек (11-14). Моннан тыш, ми тукымасының эчке күзәнәк гетерогенлыгы билгеле бер нейрон төркемчәләрендә барлыкка килә торган метаболик үзгәрешләрне өйрәнүгә зур комачаулый. Нәтиҗәдә, нейроннарда митохондриаль дисфункциянең төгәл күзәнәк һәм метаболик нәтиҗәләре турында аз мәгълүмат билгеле.
Митохондрия дисфункциясенең метаболик нәтиҗәләрен аңлау өчен, без митохондрия тышкы мембрана кушылуы (Mfn2) җимерелүе аркасында килеп чыккан нейродегенерациянең төрле стадияләрендәге Пуркинье нейроннарын (PN) аердык. Кешеләрдә Mfn2 мутацияләре Шаркот-Мари-Тот 2А тибындагы (15) нәселдәнлек мотор сенсор нейропатиясе формасы белән бәйле булса да, тычканнарда Mfn2 шартлы җимерелүе оксидлашуның индукциясе фосфорлашу (OXPHOS) дисфункция ысулы буларак танылган. Төрле нейрон төрләре (16-19) һәм нәтиҗәдә барлыкка килгән нейродегенератив фенотип хәрәкәт бозылулары (18, 19) яки мичек атаксиясе (16) кебек прогрессив неврологик симптомнар белән бергә бара. Ярлыксыз санлы (LFQ) протеомика, метаболомика, визуализация һәм вирусологик ысулларның комбинациясен кулланып, без прогрессив нейродегенерациянең пируват карбоксилазасын (PCx) һәм PNларның in vivo артериосклерозында катнашкан башка факторларны көчле рәвештә индукцияләвен күрсәтәбез. Ферментлар экспрессиясе. Бу ачышның актуальлеген тикшерү өчен, без Mfn2 җитмәгән PNларда PCx экспрессиясен аерым рәвештә киметтек һәм бу операциянең оксидатив стрессны көчәйтүен һәм нейродегенерацияне тизләтүен ачыкладык, шулай итеп азооспермия күзәнәк үлеменә метаболик адаптация бирүен исбатладык. MFN2нең көчле экспрессиясе каты OXPHOS җитмәү, митохондриаль ДНКның күпләп кулланылуы һәм, күрәсең, өзелгән митохондриаль челтәр белән терминаль дегенерация PNны тулысынча коткара ала, бу нейродегенерациянең бу формасы хәтта күзәнәк үлеменә кадәр авыруның алга киткән стадиясендә дә торгызыла алуын тагын да ассызыклый.
Mfn2 нокаут PN'ларындагы митохондрияләрне визуализацияләү өчен, без Cre-га бәйле митохондрияләргә сары флуоресцент аксымга (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессиясен максат итеп куярга мөмкинлек бирә торган тычкан штаммын кулландык һәм in vivo митохондрия морфологиясен тикшердек. Без PN'ларда Mfn2 генының җимерелүе митохондрия челтәренең әкренләп бүленүенә китерәчәген ачыкладык (S1A рәсеме), һәм иң иртә үзгәреш 3 атналык яшьтә ачыкланды. Киресенчә, PN күзәнәк катламының сизелерлек дегенерациясе, Calbindin иммунобуявы югалуы белән күрсәтелгәнчә, 12 атналык яшькә кадәр башланмады (1 нче рәсем, A һәм B). Митохондрия морфологиясендәге иң иртә үзгәрешләр һәм нейрон үлеменең күренмәле башлануы арасындагы вакыт туры килмәве безне күзәнәк үлеменә кадәр митохондрия дисфункциясе белән бәйле метаболик үзгәрешләрне тикшерергә этәрде. Без YFP (YFP+) экспрессияләүче PNны (1C рәсем) һәм контроль тычканнарда (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) аеру өчен флуоресценция белән активлаштырылган күзәнәкләрне сортлау (FACS) нигезендәге стратегия эшләдек, алга таба CTRL дип атала (S1B рәсем). YFP сигналының чагыштырма интенсивлыгына нигезләнгән капка стратегиясен оптимальләштерү безгә YFP+ тәнен (YFPhigh) PN булмаганнардан (YFPneg) (S1B рәсем) яки фаразланган флуоресцент аксон/дендрит фрагментларыннан (YFPlow; S1D рәсем, сулда) чистартырга мөмкинлек бирә, бу конфокаль микроскоп белән расланган (S1D рәсем, уңда). Классификацияләнгән популяциянең идентификациясен тикшерү өчен, без LFQ протеомикасын, аннары төп компонент анализын үткәрдек һәм YFPhigh һәм YFPneg күзәнәкләре арасында ачык аерма барлыгын ачыкладык (S1C рәсем). YFPhigh күзәнәкләре билгеле PN маркерларының чиста баетуын күрсәттеләр (мәсәлән, Calb1, Pcp2, Grid2 һәм Itpr3) (21, 22), ләкин нейроннарда яки башка күзәнәк төрләрендә еш экспрессияләнгән аксымнар баетылмады (1D рәсем). Бәйсез экспериментларда җыелган классификацияләнгән YFPhigh күзәнәкләрендәге үрнәкләрне чагыштыру корреляция коэффициенты > 0,9 булуын күрсәтте, бу биологик кабатлаулар арасында яхшы кабатланучанлыкны күрсәтә (S1E рәсем). Кыскасы, бу мәгълүматлар мөмкин булган PNны кискен һәм специфик изоляцияләү планыбызны раслады. Кулланылган L7-cre драйвер системасы бала тудырганнан соң беренче атнада мозаик рекомбинацияне индукцияләгәнгә күрә (23), без CTRL һәм шартлы (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) нейроннарын җыя торган тычканнарны юк итә башладык. Рекомбинация тәмамланганнан соң, ул 4 атналык яшьтә Mfn2cKO дип атала. Соңгы нокта буларак, без ачык митохондрия фрагментациясенә карамастан, PN катламы бөтен булган 8 атналык яшьне сайладык (1B рәсем һәм S1A рәсем). Гомумән алганда, без барлыгы 3013 аксымны санлаштырдык, шуларның якынча 22% ы митохондрия протеомына нигезләнгән MitoCarta 2.0 аннотацияләренә нигезләнгән (1E рәсем) (1E рәсем) (24). 8 нче атнада үткәрелгән дифференциаль ген экспрессиясе анализы барлык аксымнарның нибары 10,5% ында гына мөһим үзгәрешләр булуын күрсәтте (1F рәсем һәм S1F рәсем), шуларның 195е түбән көйләнгән һәм 120се югары көйләнгән (1F рәсем). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, бу мәгълүматлар җыелмасының "инновацион юл анализы" дифференциаль рәвештә экспрессияләнгән геннарның, нигездә, чикләнгән билгеле бер метаболик юллар җыелмасына карый икәнен күрсәтә (1G рәсем). Кызыклысы шунда ки, OXPHOS һәм кальций сигнализациясе белән бәйле юлларның кимүе кушылу җитмәгән PNларда митохондриаль дисфункциянең индукциясен расласа да, нигездә аминокислоталар метаболизмы белән бәйле башка категорияләр сизелерлек югарырак көйләнә, бу митохондриаль PNларда барлыкка килә торган метаболизмга туры килә.
(A) CTRL һәм Mfn2cKO тычканнарының мичек кисемтәләренең репрезентатив конфокаль фотосурәтләре, PNларның прогрессив югалуын күрсәтә (кальбиндин, соры); төшләр DAPI белән капма-каршы буялган. (B) (A) санлаштыру (дисперсиянең берьяклы анализы, ***P<0.001; n = өч тычканнан 4-6 түгәрәк). (C) Эксперименталь эш процессы. (D) Пуркиньега (өстә) һәм башка күзәнәк төрләренә (уртада) хас маркерларның җылылык картасы бүленеше. (E) Классификацияләнгән PNда ачыкланган митохондриаль аксымнар санын күрсәтүче Венн диаграммасы. (F) 8 атнада Mfn2cKO нейроннарында дифференциаль рәвештә экспрессияләнгән аксымнарның вулкан графигы (1.3 әһәмиятлелек чик кыйммәте). (G) Иҗади юл анализы 8 атна дип классификацияләнгән Mfn2cKO PNдагы биш иң мөһим күтәрелү-регуляция (кызыл) һәм төшү-регуляция (зәңгәр) юлны күрсәтә. Һәр ачыкланган аксымның уртача экспрессия дәрәҗәсе күрсәтелгән. Соры төстәге җылылык картасы: көйләнгән P кыйммәте. нс, мөһим түгел.
Протеомика мәгълүматлары I, III һәм IV комплексларының аксым экспрессиясенең әкренләп кимегәнен күрсәтте. I, III һәм IV комплексларының барысында да мөһим mtDNA белән кодланган субберәмлекләр бар иде, ә бары тик ядро ​​белән кодланган II комплекс, нигездә, тәэсирләнмәде (2A рәсем һәм S2A рәсем). . Протеомика нәтиҗәләренә туры китереп, миче тукымалары кисемтәләренең иммуногистохимиясе PNдагы IV комплексның MTCO1 (митохондриаль цитохром С оксидаза субберәмлеге 1) субберәмлеге дәрәҗәсе әкренләп кимегәнен күрсәтте (2B рәсем). mtDNA белән кодланган Mtatp8 субберәмлеге сизелерлек кимегән (S2A рәсем), ә ядро ​​белән кодланган АТФ синтаза субберәмлегенең стационар халәт дәрәҗәсе үзгәрешсез калган, бу mtDNA экспрессиясе тотрыклы булганда билгеле тотрыклы АТФ синтаза субберәмлеге F1 комплексы белән туры килә. Формалашу тотрыклы. Үзгәреш (7). Реаль вакыт полимераз чылбыр реакциясе (qPCR) ярдәмендә сортланган Mfn2cKO PN'ларындагы мтДНК дәрәҗәсен бәяләү мтДНК күчермә санының әкренләп кимүен раслады. Контроль төркем белән чагыштырганда, 8 атналык яшьтә мтДНК дәрәҗәсенең якынча 20% ы гына сакланган (2C рәсем). Бу нәтиҗәләргә туры китереп, ДНКны ачыклау өчен Mfn2cKO PN'ларның конфокаль микроскопия буявы кулланылды, бу митохондриаль нуклеотидларның вакытка бәйле кулланылуын күрсәтте (2D рәсем). Без митохондриаль аксым деградациясендә һәм стресс реакциясендә катнашкан кайбер кандидатларның гына югарырак көйләнгәнен ачыкладык, шул исәптән Lonp1, Afg3l2 һәм Clpx, һәм OXPHOS комплексы җыю факторлары. Апоптозда катнашкан аксымнар дәрәҗәсендә әһәмиятле үзгәрешләр ачыкланмады (S2B рәсем). Шулай ук, без кальций ташуында катнашкан митохондрия һәм эндоплазматик челтәр каналларында кечкенә үзгәрешләр генә булуын ачыкладык (S2C рәсем). Моннан тыш, аутофагия белән бәйле аксымнарны бәяләүдә әһәмиятле үзгәрешләр табылмады, бу иммуногистохимия һәм электрон микроскопия ярдәмендә in vivo күзәтелгән аутофагосомаларның күренмәле индукциясе белән туры килә (S3 рәсем). Ләкин, PN'ларда OXPHOS дисфункциясенең прогрессив булуы ачык ультраструктур митохондриаль үзгәрешләр белән бергә бара. 5 һәм 8 атналык Mfn2cKO PN'ларның күзәнәк тәннәрендә һәм дендрит агачларында митохондриаль кластерларны күрергә мөмкин, һәм эчке мембрана структурасы тирән үзгәрешләргә дучар булган (S4, A һәм B рәсемнәре). Бу ультраструктур үзгәрешләргә һәм мтДНКның сизелерлек кимүенә туры китереп, тетраметилродамин метил эфиры (TMRM) белән кискен баш мие миче кисәкләрен анализлау Mfn2cKO PN'ларда митохондриаль мембрана потенциалының сизелерлек кимүен күрсәтте (S4C рәсеме).
(A) OXPHOS комплексы экспрессия дәрәҗәсенең вакыт курсы анализы. 8 атнада P<0.05 булган аксымнарны гына карагыз (ике яклы ANOVA). Нокталы сызык: CTRL белән чагыштырганда көйләү юк. (B) Сулда: MTCO1 антителасы белән билгеләнгән мичәчек кисемтәсенә мисал (масштаблы сызык, 20 мкм). Пуркинье күзәнәк җисемнәре биләгән мәйдан сары төс белән капланган. Уңда: MTCO1 дәрәҗәләрен санлаштыру (дисперсиянең бер яклы анализы; өч тычканнан анализланган n = 7 дән 20 гә кадәр күзәнәк). (C) сортланган PNда mtDNA күчермәсе санының qPCR анализы (дисперсиянең бер яклы анализы; n = 3 тән 7 гә кадәр тычкан). (D) Сулда: ДНК антителасы белән билгеләнгән мичәчек кисемтәсенә мисал (масштаблы сызык, 20 мкм). Пуркинье күзәнәк җисемнәре биләгән мәйдан сары төс белән капланган. Уңда: mtDNA җәрәхәтләренең санлаштыруы (дисперсиянең берьяклы анализы; өч тычканнан 5тән 9га кадәр күзәнәк). (E) Бөтен күзәнәкле патч кыскыч язмасында митоYFP + Пуркинье күзәнәкләрен күрсәтүче кискен мичек кисемтәсе мисалы (ук). (F) IV кәкресенең санлаштыруы. (G) CTRL һәм Mfn2cKO Пуркинье күзәнәкләрендә деполяризацияләүче ток инъекциясенең репрезентатив язмалары. Өске эз: APны эшләтеп җибәргән беренче импульс. Аскы эз: Максималь AP ешлыгы. (H) Постсинаптик спонтан керүләрнең (sPSP) санлаштыруы. репрезентатив язма эзе һәм аның масштаблау коэффициенты (I)дә күрсәтелгән. Өч тычканнан n = 5тән 20гә кадәр күзәнәктә анализланган дисперсиянең берьяклы анализы. Мәгълүматлар уртача ± SEM буларак күрсәтелә; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Перфорацияләнгән патч кыскыч режимын кулланып теркәлгән спонтан APның репрезентатив эзләре. Өске эз: Максималь AP ешлыгы. Аскы эз: бер APның масштаблауы. (K) Уртача һәм максималь AP ешлыгын (J) буенча санлаштырыгыз. Манн-Уитни тесты; дүрт тычканнан n = 5 күзәнәк анализланды. Мәгълүматлар уртача ± SEM буларак күрсәтелә; мөһим түгел.
8 атналык Mfn2cKO PNда OXPHOS зыяны ачыкланды, бу нейроннарның физиологик функциясенең нык аномаль булуын күрсәтә. Шуңа күрә, без 4-5 атна һәм 7-8 атнада кискен миче кисемтәләрендә бөтен күзәнәкле патч кыскычларын яздырып, OXPHOS җитмәгән нейроннарның пассив электр үзенчәлекләрен анализладык (2E рәсем). Көтелмәгәнчә, Mfn2cKO нейроннарының уртача тыныч мембрана потенциалы һәм керү каршылыгы контрольгә охшаш иде, гәрчә күзәнәкләр арасында нечкә аермалар булса да (1 нче таблица). Шулай ук, 4-5 атналык яшьтә ток-көчәнеш мөнәсәбәтендә (IV кәкресе) әһәмиятле үзгәрешләр табылмады (2F рәсем). Ләкин, 7-8 атналык Mfn2cKO нейроннары IV режимыннан исән калмады (гиперполяризация этабы), бу соңгы этапта гиперполяризация потенциалына ачык сизгерлек булуын күрсәтә. Киресенчә, Mfn2cKO нейроннарында кабатланучы гамәл потенциалы (AP) разрядларына китерә торган деполяризацияләүче токлар яхшы тозландырылган, бу аларның гомуми разряд үрнәкләренең 8 атналык контроль нейроннарныкыннан сизелерлек аерылмавын күрсәтә (1 нче таблица һәм 2G рәсем). Шулай ук, спонтан постсинаптик токларның (sPSC) ешлыгы һәм амплитудасы контроль төркемнеке белән чагыштырырлык булган, һәм вакыйгалар ешлыгы 4 атнадан 5 атнага, 7 атнадан 8 атнага кадәр арткан, охшаш арту белән (2 нче рәсем, H һәм I). PNларда синаптик өлгерү чоры (25). Охшаш нәтиҗәләр перфорацияләнгән PN патчларыннан соң алынган. Бу конфигурация күзәнәк АТФ җитешсезлекләренең мөмкин булган компенсациясен булдырмый, бу бөтен күзәнәк патч кыскычын яздыруда булырга мөмкин. Аерым алганда, Mfn2cKO нейроннарының ял итү мембранасы потенциалына һәм спонтан ату ешлыгына тәэсир итмәгән (2 нче рәсем, J һәм K). Кыскасы, бу нәтиҗәләр ачык OXPHOS дисфункциясе булган PNларның югары ешлыклы разряд үрнәкләре белән яхшы көрәшә алуын күрсәтә, бу аларга нормаль электрофизиологик җавапларны саклап калырга мөмкинлек бирә торган компенсация механизмы барлыгын күрсәтә.
Мәгълүматлар уртача ± SEM рәвешендә күрсәтелә (дисперсиянең берьяклы анализы, Холм-Сидакның күпсанлы чагыштыру тесты; *P<0.05). Берәмлек саны җәяләр белән күрсәтелгән.
Без протеомика мәгълүматлар җыелмасындагы теләсә нинди категориядә (1G рәсем) OXPHOS җитмәүчәнлегенә каршы тора алырлык юллар бармы-юкмы икәнен тикшерергә керештек, шуның белән зарарланган PN ни өчен нормаль электрофизиологияне саклый алуын аңлата (2 нче рәсем, E - K). . Протеомика анализы тармакланган чылбырлы аминокислоталар (BCAA) катаболизмында катнашкан ферментларның сизелерлек дәрәҗәдә югарырак көйләнгәнен күрсәтте (3A рәсем һәм S5A рәсем), һәм ацетил-КоА (CoA) яки сукцинил КоА соңгы продукты артериосклероз кислотасы (TCA) циклында трикарбоксилатларны тулыландыра ала. Без BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) һәм BCAT2 эчтәлегенең артканын ачыкладык. Алар α-кетоглютараттан глутамат генерацияләп, BCAA катаболизмының беренче этабын катализлыйлар (26). Тармакланган чылбырлы кето кислотасы дегидрогеназа (BCKD) комплексын тәшкил итүче барлык субберәмлекләр дә югарырак көйләнә (комплекс барлыкка килгән BCAA углерод скелетының аннан соңгы һәм кире кайтарып булмый торган декарбоксилизациясен катализлый) (3А рәсем һәм S5А рәсем). Ләкин, сортланган PNда BCAA үзендә ачык үзгәрешләр табылмады, бу күзәнәк тарафыннан бу мөһим аминокислоталарның артуы яки TCA циклын тулыландыру өчен башка чыганаклар (глюкоза яки сөт кислотасы) куллану белән бәйле булырга мөмкин (S5B рәсем). OXPHOS булмаган PNларда 8 атналык яшьтә глутамин таркалуы һәм трансаминация активлыгы артты, моны митохондриаль ферментлар глутаминаза (GLS) һәм глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) югарырак көйләнүе белән күрсәтергә мөмкин (3, А һәм С рәсем). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, GLS-ның артуы глутаминаза С (GLS-GAC) сплайсланган изоформ белән чикләнә (Mfn2cKO/CTRL үзгәреше якынча 4,5 тапкыр, P = 0,05), һәм аның яман шеш тукымаларында специфик артуы митохондрия биоэнергиясен хуплый ала (27).
(A) Җылылык картасы 8 атнада күрсәтелгән маршрут өчен аксым дәрәҗәсенең үзгәрүен күрсәтә. (B) PCx антителасы белән билгеләнгән мичәчек кисәге мисалы (шкала сызыгы, 20 мкм). Сары ук Пуркинье күзәнәк гәүдәсенә күрсәтә. (C) Атеросклероз өчен мөһим кандидат буларак билгеләнгән вакыт курсы аксым экспрессиясе анализы (күп t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 тычкан). (D) Өстә: [1-13C]пируват индикаторында булган билгеләнгән углеродны кертүнең төрле ысулларын күрсәтүче схема (ягъни, PDH яки транс-артериаль юл аша). Аста: Скрипка диаграммасында [1-13C]пируват белән кискен мичәчек кисәкләрен билгеләгәннән соң, бер билгеләнгән углеродның (M1) аспарагин кислотасына, лимон кислотасына һәм алма кислотасына әйләнү проценты күрсәтелгән (парлы t-тест; ** P <0.01). (E) Күрсәтелгән юлның комплекс вакыт тарихы анализы. 8 атнада P<0,05 булган аксымнарны гына исәпкә алыгыз. Пычкы сызык: көйләү кыйммәте юк (дисперсиянең ике яклы анализы; * P <0,05; *** P <0,001). Мәгълүматлар уртача ± SEM буларак күрсәтелә.
Безнең анализда BCAA катаболизмы төп күтәрелү юлларының берсенә әйләнде. Бу факт OXPHOS булмаган PNда TCA циклына керүче вентиляция күләме үзгәрергә мөмкин дигән фикерне нык күрсәтә. Бу нейроннарның метаболик реконверсиясенең төп формасы булырга мөмкин, бу OXPHOSның авыр дисфункциясен саклап калу вакытында нейрон физиологиясенә һәм яшәүгә турыдан-туры йогынты ясарга мөмкин. Бу гипотезага туры китереп, без төп атеросклеротик фермент PCx күтәрелүен ачыкладык (Mfn2cKO/CTRL якынча 1,5 тапкыр үзгәрә; 3А рәсем), бу пируватның оксалоацетатка әйләнүен катализлый (28), ул ми тукымасында дип санала. экспрессиясе астроцитлар белән генә чикләнгән (29, 30). Протеомика нәтиҗәләренә туры китереп, конфокаль микроскопия PCx экспрессиясенең OXPHOS җитмәгән PNларда аеруча һәм сизелерлек артуын күрсәтте, ә PCx реактивлыгы, нигездә, контроль төркемнең күрше Бергман глиаль күзәнәкләре белән генә чикләнгән (3B рәсем). PCx-ның күзәтелгән артуын функциональ яктан тикшерү өчен, без кискен миче кисәкләрен [1-13C]пируват индикаторы белән эшкәрттек. Пируват пируватдегидрогеназа (PDH) белән оксидлашкач, аның изотоп билгесе юкка чыкты, ләкин пируват кан тамырлары реакцияләре белән метаболизмга кертелгәч, TCA циклы арадашчыларына кушыла (3D рәсем). Протеомика мәгълүматларыбызны раслау өчен, без Mfn2cKO кисәкләренең аспарагин кислотасында бу индикатордан күп санлы маркерлар күзәттек, шул ук вакытта лимон кислотасы һәм алма кислотасы да уртача тенденциягә ия булды, гәрчә әһәмиятле булмаса да (3D рәсем).
МитоПарк тычканнарының дофамин нейроннары митохондриаль транскрипция факторы А генын (Tfam) махсус рәвештә җимерү сәбәпле митохондриаль дисфункциясе булган дофамин нейроннарында (S6B рәсем) PCx экспрессиясе дә сизелерлек арткан (31), бу ацетон кислотасы артериосклерозын күрсәтә. Авыруның барлыкка килүе организмдагы нейрон OXPHOS дисфункциясе вакытында көйләнә. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, артериосклероз белән бәйле булырга мөмкин нейроннарда экспрессияләнергә мөмкин булган уникаль ферментлар (32-34) OXPHOS җитмәгән PNларда сизелерлек арткан, мәсәлән, пропионил-КоА карбоксилаза (PCC-A), малонил-КоА пропионил-КоАны сукцинил-КоАга әйләндерә һәм митохондриаль алма ферменты 3 (ME3), аларның төп роле - пируватны малаттан кайтару (3 нче рәсем, А һәм С) (33, 35). Моннан тыш, без Pdk3 ферментының сизелерлек артуын ачыкладык, ул фосфорлый һәм шулай итеп PDHны активлаштырмый (36), ә PDHны активлаштыра торган Pdp1 ферментында яки PDH фермент комплексының үзендә бернинди үзгәрешләр дә ачыкланмады (3А рәсем). Mern2cKO PN'ларында, Ser293'тә PDH комплексының пируватдегидрогеназа E1 компонентының α1 субберәмлеге α (PDHE1α) субберәмлегенең фосфорлануы көчәйгән (PDH фермент активлыгын тоткарлый дип билгеле) (S6C рәсем) (S6C рәсем). Пируватның кан тамырларына керү мөмкинлеге юк.
Ниһаять, без серин һәм глицин биосинтезының супер юлы, митохондриаль фолат (1C) циклы һәм пролин биосинтезы (1G һәм S5C рәсемнәре) активлаштыру процессы вакытында сизелерлек дәрәҗәдә югары көйләнүен ачыкладык. Тирә-юньдәге тукымаларның митохондриаль дисфункциясе белән активлашуы күзәтелә (5-7). Бу протеомика мәгълүматларын раслаучы конфокаль анализ күрсәткәнчә, OXPHOS булмаган PNда 8 атналык тычканнарның миче кисәкләре митохондриаль фолат циклының төп ферменты булган серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2) белән тәэсирләнгән. Иммун җавапның әһәмиятле булуы күзәтелә (S5D рәсеме). 13 CU-глюкоза белән инкубацияләнгән кискен миче кисәкләрендә метаболик күзәтү экспериментлары серин һәм пролин биосинтезының югары көйләнүен тагын да раслады, бу углерод изоформаларының серин һәм пролинга агымы артканлыгын күрсәтә (S5E рәсеме). GLS һәм GPT2 тарафыннан этәргечләнгән реакцияләр глутаминнан глутамат синтезы һәм глутамат белән α-кетоглютарат арасындагы трансаминация өчен җаваплы булганлыктан, аларның артуы OXPHOS җитмәгән нейроннарда глутаматка ихтыяҗ артуын күрсәтә. Бу пролин биосинтезының артуын саклап калуга юнәлтелгән булырга мөмкин (S5C рәсем). Бу үзгәрешләрдән аермалы буларак, PN-специфик Mfn2cKO тычканнарыннан алынган миче астроцитларының протеомик анализы бу юлларның (барлык антипероксидазаларны да кертеп) экспрессиядә сизелерлек үзгәрмәвен күрсәтте, бу метаболик юнәлешнең таркалган PN өчен сайлап булуын күрсәтә (S6 рәсем, D - G).
Кыскасы, бу анализлар PN'ларда билгеле бер метаболик юлларның вакытлы активлашуының шактый төрле үрнәкләрен ачыклады. Нейрон митохондриаль функциясенең аномаль булуы атеросклерозның иртә этабына һәм 1C ремоделингына (3E рәсем һәм S5C рәсем), хәтта I һәм IV комплекслары экспрессиясендә фаразланырлык үзгәрешләргә китерергә мөмкин булса да, серин де ново синтезындагы үзгәрешләр бары тик соңгы стадияләрдә генә ачыклана башлады. OXPHOS дисфункциясе (3E рәсем һәм S5C рәсем). Бу нәтиҗәләр стресс китереп чыгарган митохондриаль (1C циклы) һәм цитоплазматик (серин биосинтезы) TCA циклында атеросклероз арту белән синергетик рәвештә җавап бирә торган эзлекле процессны билгели. Нейрон метаболизмын үзгәртү өчен.
8 атналык OXPHOS җитмәгән PNлар югары ешлыклы кузгату активлыгын саклый ала һәм митохондриаль дисфункцияне компенсацияләү өчен зур метаболик кабат тоташуга дучар була ала. Бу ачыш хәтта шушы вакытта да бу күзәнәкләр нейродегенерацияне тоткарлау яки булдырмау өчен терапевтик ярдәм ала ала дигән кызыклы мөмкинлекне тудыра. Соңрак. Без бу мөмкинлекне ике бәйсез ярдәм ярдәмендә хәл иттек. Беренче ысулда без Cre-га бәйле адено-ассоциацияләнгән вирус (AAV) векторын эшләдек, шуңа күрә MFN2 in vivo OXPHOS җитмәгән PNларда сайлап экспрессияләнә ала (S7A рәсем). MFN2 кодлаучы AAV һәм флуоресцент репортер гены mCherry (Mfn2-AAV) in vitro беренчел нейрон культураларында тикшерелде, бу MFN2-ның Cre-га бәйле рәвештә экспрессияләнүенә китерде һәм митохондриаль морфологияне коткарды, шуның белән Mfn2cKO нейроннарында нейромутацияне булдырмады (S7, B, D һәм E рәсемнәре). Аннары без 8 атналык Mfn2-AAVны Mfn2cKO һәм контроль тычканнарның миче кабыгына стереотактик рәвештә җиткерү өчен in vivo экспериментлар үткәрдек һәм 12 атналык тычканнарны анализладык (4А рәсем). Дәваланган Mfn2cKO тычканнары үлгән (1, А һәм В рәсем) (16). Вирус трансдукциясе in vivo кайбер миче түгәрәкләрендә PN селектив экспрессиясенә китергән (S7, G һәм H рәсем). Бары тик mCherry (Ctrl-AAV) экспрессияләүче контроль AAV инъекциясе Mfn2cKO хайваннарында нейродегенерация дәрәҗәсенә әһәмиятле йогынты ясамаган. Киресенчә, Mfn2-AAV белән трансдукцияләнгән Mfn2cKO анализы PN күзәнәк катламының әһәмиятле саклагыч эффектын күрсәтте (4, B һәм C рәсем). Аерым алганда, нейрон тыгызлыгы контроль хайваннардан аерылгысыз диярлек кебек (4, B һәм C рәсем, һәм S7, H һәм I рәсем). MFN1 экспрессиясе, ләкин MFN2 түгел, нейрон үлемен саклап калуда бертигез нәтиҗәле (4C рәсем һәм S7, C һәм F рәсемнәре), бу эктопик MFN1 экспрессиясе MFN2 җитмәүне нәтиҗәле рәвештә тулыландыра алуын күрсәтә. Бер PN дәрәҗәсендә алга таба анализ Mfn2-AAV митохондрияләрнең ультратструктурасын күбесенчә коткарганын, мтДНК дәрәҗәләрен нормальләштергәнен һәм ангиогенезга каршы маркер PCx'ның югары экспрессиясен кире кайтарганын күрсәтте (4 нче рәсем, C - E). Коткарылган Mfn2cKO тычканнарын тыныч хәлдә визуаль тикшерү аларның торышы һәм хәрәкәт симптомнары (S1 - S3 хәрәкәте) яхшырганын күрсәтте. Нәтиҗә ясап шуны әйтергә мөмкин, бу экспериментлар OXPHOS җитмәгән PN'ларга MFN2'ны соңга калдырып кабат кертү мтДНК куллануны кире кайтару һәм атеросклерозны китереп чыгару өчен җитәрлек, шуның белән аксон дегенерациясен һәм нейрон үлемен in vivo булдырмаска ярдәм итә.
(A) Күрсәтелгән метаболик юл активлаштырылганда MFN2 кодлаучы AAV инъекциясенең эксперименталь графигын күрсәтүче схема. (B) 8 атнада Mfn2cKO тычканнарында трансдукцияләнгән һәм Кальбиндинга каршы антитәнчек белән билгеләнгән 12 атналык мичәк кисәкләренең типик конфокаль рәсемнәре. Уңда: Аксон җепселләренең масштаблануы. Аксон зумының масштабы 450 һәм 75 мкм. (C) Сулда: AAV трансдукция элмәгендә (AAV+) Пуркинье күзәнәк тыгызлыгын санлаштыру (дисперсиянең берьяклы анализы; n = 3 тычкан). Уңда: 12 атнада трансдукцияләнгән PNда мтДНК фокус анализы (парланмаган t-тест; өч тычканнан n = 6 күзәнәк). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Күрсәтелгән вирус векторлары белән трансдукцияләнгән Mfn2cKO мичәк кисемтәләренең PNларының типик трансмиссия электрон микрографияләре. Алсу битлек дендритлар биләгән мәйданны күрсәтә, ә сары нокталы квадрат уң якта бирелгән масштабны күрсәтә; n үзәкне күрсәтә. Масштаб сызыгы, 1 мкм. (E) 12 атнада PNда трансдукцияләнгән PCx буяу мисалын күрсәтә. Масштаб сызыгы, 20 мкм. OE, артык экспрессия; FC, бөкләнү үзгәреше.
Ниһаять, без OXPHOS дисфункциясен кичергән PNларда пероксидаза белән индукцияләнгән күзәнәкләрнең яшәү әһәмиятен тикшердек. Без тычкан PCx мРНКсын (AAV-shPCx) махсус максат итеп куйган AAV-shRNA (кыска чәчле РНК) кодлаучы mCherry генерацияләдек һәм вирусны яки аның кушылган контролен (AAV-scr) Mfn2cKO тычканнарының миенә керттек. Инъекция дүртенче атнада башкарылды (5А рәсем), PCx экспрессиясе арткан чорда (3C рәсем) һәм PN күзәнәк катламы әле дә сакланган чорда PCx-ны нәтиҗәле нокдаунга ирешү өчен (1А рәсем). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, PCx-ны нокдаунга китерү (S8A рәсем) PN үлеменең сизелерлек тизләнешенә китерә, бу инфекцияләнгән боҗра белән чикләнә (5, B һәм C рәсемнәр). PCx арту-регуляциясе белән китереп чыгарылган метаболик эффектлар механизмын аңлау өчен, без PCx нокауны һәм AAV аша оптик биосенсор Grx1-roGFP2 бер үк вакытта экспрессияләнгәннән соң PNларның редокс статусын өйрәндек (S8 нче рәсем, B - D), глутатионны бәяләү өчен. Пептид редокс потенциалының чагыштырмача үзгәреше (38). Аннары, без FLIM шартларын тикшергәннән соң цитоплазматик редокс статусындагы потенциаль үзгәрешләрне ачыклау өчен 7 атналык Mfn2cKO яки контроль кошларның кискен ми кисәкләрендә ике фотонлы флуоресценция гомерлек сурәтләү микроскопиясен (FLIM) үткәрдек (S8 нче рәсем, E - G). Анализ PCx экспрессиясе булмаган бер Mfn2cKO PNларының оксидлашу дәрәҗәсенең сизелерлек артуын күрсәтте, бу контроль нейроннардан яки Mfn2cKO PNнарыннан аерылып тора, алар бары тик кушылган shRNA экспрессияли (5 нче рәсем, D һәм E). PCx экспрессиясе кимегән вакытта, югары оксидлашу халәтен күрсәтүче Mfn2cKO PNларның проценты өч тапкырдан артык арткан (5E рәсем), бу PCx-ның югарырак регуляциясе дегенерацияләнгән нейроннарның оксидлашу-калыну сәләтен саклап калуын күрсәтә.
(A) Күрсәтелгән метаболик юл активлаштырылганда, shPCx кодлаучы AAV инъекциясенең эксперименталь графигын күрсәтүче схема. (B) 4 атнада кальциневринга каршы антитәнчек белән трансдукцияләнгән һәм билгеләнгән Mfn2cKO тычканнарында 8 атналык мичә кисемтәләренең репрезентатив конфокаль фотосурәтләре. Шкала, 450 мкм. (C) AAV трансдукцияләнгән элмәкләрдә Пуркинье күзәнәкләренең тыгызлыгын санлаштыру (дисперсиянең берьяклы анализы; n = 3-4 тычкан). Мәгълүматлар уртача ± SEM буларак күрсәтелә; ***P<0.001. (D) FLIM репрезентатив рәсеме билгеләнгән эксперименталь шартларда 7 атналык PN экспрессияләүче глутатион редокс сенсоры Grx1-roGFP2 уртача гомер озынлыгын күрсәтә. LUT (эзләү таблицасы) нисбәте: яшәү вакыты аралыгы (пикосекундларда). Шкала, 25 мкм. (E) Гистограмма (D) дан Grx1-roGFP2 гомер озынлыгы кыйммәтләренең бүленешен күрсәтә (һәр шартта ике тычкандагы n=158 дән 368 күзәнәккә кадәр). Һәр гистограмма өстендәге түгәрәк диаграмма: CTRL-AAV-scr уртача гомер озынлыгы кыйммәтенең 1 SD тан артып киткән, шактый озынрак (кызыл, оксидлашкан) яки кыскарак (зәңгәр, киметелгән) гомер озынлыгы кыйммәтләренә ия булган күзәнәкләр санын күрсәтә. (F) Тәкъдим ителгән модель нейрон PCx артуының саклау эффектын күрсәтә.
Гомумән алганда, без монда биргән мәгълүматлар MFN2 реэкспрессиясенең каты OXPHOS җитмәүчәнлеге, каты mtDNA кимүе һәм бик аномаль istа-сыман морфология белән алга киткән PNны тулысынча коткара алуын күрсәтә, шуның белән хәтта алга киткән авыруларда да өзлексез үсеш тәэмин итә. Нейродегенерация күзәнәк үлеменә кадәрге стадиянең кире кайтарыла торган дәлилләрен бирә. Метаболик сыгылучанлыкның бу дәрәҗәсе нейроннарның атеросклерозны (TCA циклының яңадан кушылуы) китереп чыгару сәләте белән тагын да ассызыклана, ул OXPHOS булмаган PNларда PCx экспрессиясен тоткарлый һәм күзәнәк үлемен көчәйтә, шуның белән саклаучы роль уйный (5F рәсем).
Бу тикшеренүдә без PN-ларның OXPHOS дисфункциясенә җавабы метаболик программалар тарафыннан активлаштырылган дифференциаль активация юлы аша TCA цикл атеросклерозына әкренләп якынлашуын раслый торган дәлилләр китердек. Без протеомик анализны күп өстәмә ысуллар белән расладык һәм митохондриаль дисфункция белән авырышка очраганда, нейроннарның метаболик эластиклыкның элек билгесез формасына ия булуын ачыкладык. Гаҗәпләндерерлек, бөтен яңадан бәйләү процессы нейродегенерация белән әкренләп һәм кире кайтмаслык рәвештә озатып баручы терминаль метаболик халәтне билгеләми, ләкин безнең мәгълүматлар аның күзәнәк үлеменә кадәрге этапта да саклаучы нейрон булып хезмәт итә алуын күрсәтә. Функциональ компенсация механизмы. Бу ачыш нейроннарның организмда метаболик пластиклыкның шактый югары дәрәҗәсенә ия булуын күрсәтә. Бу факт MFN2-нең соңрак кабат кертелүе төп метаболик маркерларның экспрессиясен кире кайтара һәм PN дегенерациясен булдырмый алачагын исбатлый. Киресенчә, ул атеросклерозны тоткарлый һәм нервларны тизләтә. транссексуал.
Безнең тикшеренүләрдә иң кызыклы ачышларның берсе - OXPHOS булмаган PNларның артериосклерозны махсус стимуллаштыручы ферментларны көчәйтү юлы белән TCA циклы метаболизмын үзгәртә алуы. Метаболик үзгәртеп кору - яман шеш күзәнәкләренең гадәти үзенчәлеге, аларның кайберләре TCA циклы арадашларын тулыландыру өчен глутаминга таяна, алар редукцион эквивалентлар җитештерә, алар сулыш чылбырын эшләтә һәм липидлар һәм нуклеотидлар биосинтезы прекурсорлары җитештерүен саклый (39, 40). Күптән түгел үткәрелгән тикшеренү OXPHOS дисфункциясен кичергән периферик тукымаларда глутамин/глутамат метаболизмының яңадан тоташуы да күренекле үзенчәлек булуын күрсәтте (5, 41), анда глутаминның TCA циклына керү юнәлеше OXPHOS җәрәхәтенең авырлыгына бәйле (41). Ләкин, организмдагы нейроннарның метаболик пластиклыгының охшашлыгы һәм аның авыру контекстындагы мөмкин булган әһәмияте турында ачык дәлилләр юк. Күптән түгел үткәрелгән in vitro тикшеренүдә беренчел кортикаль нейроннарның нейротрансмиссия өчен глутамат пулларын мобилизацияләве, шуның белән метаболик стресс шартларында оксидлашу метаболизмын һәм атеросклерозны стимуллаштыруы күрсәтелде (42). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, TCA циклы ферменты сукцинатдегидрогеназа фармакологик ингибирлавы астында пируват карбоксиллануы культураланган мичек гранула нейроннарында оксалоацетат синтезын саклый дип санала (34). Ләкин бу механизмнарның ми тукымалары өчен физиологик әһәмияте (атеросклероз, нигездә, астроцитлар белән чикләнгән дип саналганда) әле дә мөһим физиологик әһәмияткә ия (43). Бу очракта, безнең мәгълүматлар күрсәткәнчә, организмда OXPHOS белән зарарланган PN'лар BCAA деградациясенә һәм пируват карбоксиллануына күчә ала, алар TCA пулының арадаш продуктларын тулыландыруның ике төп чыганагы булып тора. BCAA катаболизмының нейрон энергия метаболизмына фаразланган өлеше тәкъдим ителсә дә, нейротрансмиссия өчен глутамат һәм GABA роленнән тыш (44), бу механизмнар өчен in vivo дәлилләр әле дә юк. Шуңа күрә, дисфункциональ PN'лар атеросклерозны көчәйтү юлы белән ассимиляция процессы белән бәйле TCA арадаш продуктларын куллануны автоматик рәвештә компенсацияли ала дип фаразлау җиңел. Аерым алганда, митохондриаль дисфункцияле пролиферацияләүче күзәнәкләрдә аспарагин кислотасына ихтыяҗның артуын саклап калу өчен PCx-ның югарырак регуляциясе кирәк булырга мөмкин (45). Ләкин, безнең метаболомика анализы Mfn2cKO PN-ларында аспарагин кислотасының тотрыклы халәт дәрәҗәсендә бернинди дә әһәмиятле үзгәрешләр ачыкламады (S6A рәсем), бу, мөгаен, пролиферацияләүче күзәнәкләр һәм митоздан соңгы нейроннар арасында аспарагин кислотасының төрле метаболик кулланылышын чагылдыра. In vivo дисфункциональ нейроннарда PCx-ның югарырак регуляциясенең төгәл механизмы әлегә характерланырга тиеш булса да, без бу вакытыннан алда җавапның нейроннарның редокс халәтен саклап калуда мөһим роль уйнавын күрсәттек, бу FLIM экспериментларында мичә кисәкләрендә күрсәтелгән. Аерым алганда, PN-нарның PCx-ны югарырак регуляцияләвенә юл куймау оксидлашу халәтенә китерергә һәм күзәнәк үлемен тизләтергә мөмкин. BCAA деградациясенең активлашуы һәм пируватның карбоксиллануы митохондриаль дисфункциянең периферик тукымаларын характерлау ысуллары түгел (7). Шуңа күрә алар OXPHOS җитмәгән нейроннарның өстенлекле үзенчәлеге булып күренә, хәтта бердәнбер үзенчәлек булмаса да, бу нейродегенерация өчен мөһим.
Баш мие авыруы - гадәттә атаксия буларак күренә торган һәм еш кына PN-ларга зыян китерә торган гетероген нейродегенератив авыру төре (46). Бу нейрон популяциясе митохондриаль дисфункциягә аеруча бирешүчән, чөнки тычканнардагы сайлап алу дигәнерүе кеше спиносеребелляр атаксиясен характерлый торган күп кенә хәрәкәт симптомнарын кабатлау өчен җитәрлек (16, 47, 48). Хәбәрләргә караганда, мутант генлы трансген тычкан моделе кеше спиносеребелляр атаксиясе белән бәйле һәм митохондриаль дисфункциягә ия (49, 50), бу PNPH-та OXPHOS җитмәү нәтиҗәләрен өйрәнүнең мөһимлеген ассызыклый. Шуңа күрә, бу уникаль нейрон популяциясен нәтиҗәле аеру һәм өйрәнү аеруча кулай. Ләкин, PN-лар басымга бик сизгер һәм бөтен баш мие күзәнәкләре популяциясенең аз өлешен тәшкил итүен исәпкә алганда, күп кенә омикага нигезләнгән тикшеренүләр өчен аларны бөтен күзәнәкләр буларак сайлап аеру әле дә катлаулы аспект булып тора. Башка күзәнәк төрләренең (бигрәк тә өлкән тукымаларның) пычрануын тулысынча булдырмау мөмкин түгел диярлек булса да, без FACS белән нәтиҗәле диссоциация этабын берләштердек, протеомика анализы өчен җитәрлек санда яшәүчән нейроннар алдык һәм бөтен мичәкнең гамәлдәге мәгълүматлар җыелмасы белән чагыштырганда шактый югары аксым каплавына ия булдык (якынча 3000 аксым) (51). Бөтен күзәнәкләрнең яшәүчәнлеген саклап калып, без монда тәкъдим иткән ысул митохондрияләрдә метаболик юллардагы үзгәрешләрне генә түгел, ә аның цитоплазматик аналогларындагы үзгәрешләрне дә тикшерергә мөмкинлек бирә, бу митохондрия мембрана тегларын куллануны тулыландыра, күзәнәк төрен баету өчен. Катлаулы тукымаларда митохондрияләр саны өчен яңа ысул (52, 53). Без тасвирлаган ысул Пуркинье күзәнәкләрен өйрәнү белән генә бәйле түгел, ә авыру миләрдәге метаболик үзгәрешләрне, шул исәптән митохондрия дисфункциясенең башка модельләрен дә хәл итү өчен теләсә нинди күзәнәк төренә җиңел кулланылырга мөмкин.
Ниһаять, без бу метаболик үзгәртеп кору процессы вакытында күзәнәк стрессының төп билгеләрен тулысынча кире кайтара һәм нейрон дегенерациясен булдырмый кала торган терапевтик тәрәзәне ачыкладык. Шуңа күрә, монда тасвирланган яңадан тоташтыруның функциональ нәтиҗәләрен аңлау митохондриаль дисфункция вакытында нейроннарның яшәүчәнлеген саклап калу өчен мөмкин булган дәвалау ысуллары турында төп мәгълүмат бирә ала. Бу принципның башка неврологик авыруларга кулланылышын тулысынча ачыклау өчен, башка ми күзәнәкләрендәге энергия метаболизмындагы үзгәрешләрне анализлауга юнәлтелгән киләчәк тикшеренүләр кирәк.
MitoPark тычканнары элегрәк тасвирланган иде (31). loxP фланкларындагы Mfn2 геннары булган C57BL/6N тычканнары элегрәк тасвирланган иде (18) һәм L7-Cre тычканнары белән кроссировкаланган иде (23). Нәтиҗәдә барлыкка килгән икеләтә гетерозиготалы токым аннары гомозиготалы Mfn2loxP/Mfn2loxP тычканнары белән кроссировкаланган, Mfn2 өчен Пуркиньега хас ген нокаутлары (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Парлашуның бер өлешендә Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллелы (stop-mtYFP) өстәмә кроссировкалар аша кертелгән (20). Барлык хайваннар белән дә процедуралар Европа, милли һәм институт күрсәтмәләренә туры китереп башкарылган һәм Төньяк Рейн-Вестфалия, Германиянең Умвельт һәм Вербраухершутц шәһәрләреннән LandesamtfürNatur тарафыннан расланган. Хайваннар белән эшләү шулай ук ​​Европа Лаборатория Хайваннары Фәннәре Ассоциацияләре Федерациясе җитәкчелегенә буйсына.
Йөкле хатын-кызның муен чыгуын наркозлаганнан соң, тычкан эмбрионы аерыла (E13). Кортекс 10 мМ Хепес белән тулыландырылган Хэнкс баланслы тоз эремәсендә (HBSS) кисеп алынды һәм папаин (20 U/мл) һәм цистеин (1 мкг/мл) булган Дульбекко модификацияләнгән бөркет уртачасына тапшырылды. Тукыманы DMEMда инкубацияләгез һәм ферментатив эшкәртү юлы белән диссоциацияләгез. Ml) 37°C температурада 20 минут дәвамында, аннары 10% феталь сыер сывороткасы белән тулыландырылган DMEMда механик рәвештә тартылды. Күзәнәкләр полилизин белән капланган пыяла тышчаларга 6 см культура савытына 2 × 106 тыгызлыкта яки визуаль анализ өчен 0,5 × 105 күзәнәк/см2 тыгызлыгында чәчелде. 4 сәгатьтән соң, уртача сыворотка 1% B27 өстәмәсе һәм 0,5 мМ GlutaMax булган Нейробазаль сывороткасыз уртача сыворотка белән алыштырылды. Аннары нейроннар эксперимент дәвамында 37°C температурада һәм 5% CO2да тотылды һәм атнага бер тапкыр тукландырылды. In vitro рекомбинациясен стимуллаштыру өчен, in vitro икенче көнендә нейроннарны дәвалау өчен түбәндәге AAV9 вирус векторының 3 мкл (24 чокырлы культура савыты) яки 0,5 мкл (24 чокырлы пластина) кулланылды: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, каталог номеры 105530-AAV9) һәм AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталог номеры 105545-AAV9).
Тычкан Mfn1 һәм Mfn2 комплементар ДНКсы (Addgene плазмидасыннан алынган #23212 һәм #23213) C-терминалында V5 эзлеклелеге (GKPIPNPLLGLDST) белән билгеләнә һәм T2A эзлеклелеге аша mCherry белән кушыла. Grx1-roGFP2 - Гейдельберг Т.П. Дик DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) бүләге. Гадәти клонлаштыру ысулларын кулланып, tdTomato кассетасын алыштыру юлы белән, кассета pAAV-CAG-FLEX-tdTomato магистраленә (Addgene белешмә номеры 28306) субклонлаштырылып, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 һәм pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 векторлары барлыкка китерелде. pAAV-CAG-FLEX-mCherry контроль векторын булдыру өчен охшаш стратегия кулланылды. AAV-shPCx конструкциясен булдыру өчен, плазмидалы AAV векторы (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) кирәк, ул тычкан PCx'ка юнәлтелгән shRNA кодлаучы ДНК эзлеклелеген үз эченә ала (5′CTTTCGCTCAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAG 3′). U6 промоторы контролендә, CMV промоторы контролендә mCherry кулланыла. Ярдәмче AAV векторларын җитештерү җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп башкарылды (Cell Biolabs). Кыскасы, кальций фосфаты ысулын кулланып, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) йөртүче күчерү плазмидасын кулланыгыз. 293AAV күзәнәкләре-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) яки Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодлаучы генны, шулай ук ​​AAV1 капсид аксымын һәм өстәмә аксымын кодлау өчен плазмид плазмидасын кальций фосфаты ысулын кулланыгыз. Чи вирус өслеге коры боз/этанол мунчасында туңдыру-эретү цикллары һәм фосфат буферлы тозлы эремәдә (PBS) лизисланган күзәнәкләр ярдәмендә алынган. AAV векторы өзлексез йодиксанол градиентлы ультрацентрифугалау ярдәмендә чистартылды (32,000 әйләнү/мин һәм 4°C температурада 24 сәгать) һәм Amicon ультра-15 үзәктән качу фильтры ярдәмендә концентрацияләнде. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 геном күчермәсе (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX геном титрлары элек тасвирланганча (54), реаль вакыт санлы ПЦР (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/мл) һәм AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/мл) ярдәмендә үлчәнде.
Беренчел нейроннар боз кебек салкын 1x PBS'та кырылып алынды, гранулаланды, аннары фосфатаза һәм протеаза ингибиторын үз эченә алган 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолат/PBS лизис буферында (Roche) гомогенлаштырылды. Аксымның күләмен билгеләү бицинхонин кислотасы анализы (Thermo Fisher Scientific) ярдәмендә башкарылды. Аннары аксымнар SDS-полиакриламид гель электрофорезы ярдәмендә аерылды, аннары поливинилиден фторид мембранасына блотланды (GE Healthcare). Специфик булмаган урыннарны блоклагыз һәм беренчел антитәнчек белән (тулырак мәгълүмат өчен S1 таблицасын карагыз) 5% сөттә TBST'та (Tween белән Tris-буферланган тозлы эремә), юу этапларында һәм TBST Incubate'та икенчел антитәнчек белән инкубацияләгез. Беренчел антитәнчек белән +4°C температурада төнлә инкубацияләгез. Юганнан соң, икенчел антитәнчекне бүлмә температурасында 2 сәгать кулланыгыз. Аннары, шул ук блотны анти-β-актин антитәнчеге белән инкубацияләү юлы белән, шул ук йөкләнеш расланды. Хемилюминесценциягә әйләндерү һәм хемилюминесценцияне көчәйтү юлы белән ачыклау (GE Healthcare).
Элегрәк пыяла каплаулы пластиналарга урнаштырылган нейроннар билгеләнгән вакытта бүлмә температурасында 10 минут дәвамында 4% параформальдегид (PFA)/PBS белән фиксацияләнде. Башта каплаулы пластиналарга бүлмә температурасында 5 минут дәвамында 0,1% Triton X-100/PBS кертелде, аннары блоклаучы буферда [3% сыер сывороткасы альбумины (BSA)/PBS] кулланылды. Икенче көнне каплаулы пластиналар блоклаучы буфер белән юылды һәм тиешле флуорофор белән конъюгацияләнгән икенчел антитәнчек белән бүлмә температурасында 2 сәгать инкубацияләнде; ахырда, үрнәкләр PBSта яхшылап юылды, 4′,6-диамидино-2-Фенилиндол (DAPI) каршы буялды һәм аннары микроскоп слайдына Aqua-Poly/Mount белән фиксацияләнде.
Тычканнарга (ат һәм ана) кетамин (130 мг/кг) һәм ксилазин (10 мг/кг) корсак эченә инъекция ясап анестезия ясалды һәм карпрофен анальгетик дару (5 мг/кг) тире астына кертелде. Һәм җылы подгузник белән җиһазландырылган стереотактик инструментка (Kopf) урнаштырылды. Баш сөяген ачыгыз һәм теш бораулаучы ярдәмендә миче кабыгының түбән сөяккә туры килгән өлешен нечкәртегез (лямбдадан: койрык 1.8, ян 1, IV һәм V өлешчәләренә туры килә). Астагы кан тамырларын бозмас өчен, баш сөягендә кечкенә тишек ясау өчен кәкре шприц энәсен кулланыгыз. Аннары нечкә сузылган пыяла капилляр микротишеккә әкрен генә кертелә (каты тышчаның вентраль ягында -1.3 дән -1 гә кадәр), һәм 200 дән 300 нл га кадәр AAV кул шприцлары (Наришиге) белән микроинъекторга (Наришиге) берничә тапкыр түбән басым астында 10-20 минут аралыгында кертелә. Инфузиядән соң, вирус тулысынча таралсын өчен, капиллярны тагын 10 минутка куегыз. Капиллярлар алынганнан соң, яра ялкынсынуын киметү һәм хайванның савыгуы өчен тирене җентекләп тегәләр. Операциядән соң берничә көн дәвамында хайваннарга авыртуны баса торган дарулар (каспофен) бирделәр, бу вакыт эчендә аларның физик хәле игътибар белән күзәтелде, аннары билгеләнгән вакытта эвтаназия ясалды. Барлык процедуралар да Европа, милли һәм институт күрсәтмәләренә туры китереп башкарылды һәм Германиянең Төньяк Рейн-Вестфалия штатындагы Умвельт һәм Вербраухершутц шәһәрендәге LandesamtfürNatur тарафыннан расланды.
Хайваннарга кетамин (100 мг/кг) һәм ксилазин (10 мг/кг) белән наркоз бирелде, һәм йөрәккә башта 0,1 М PBS, аннары PBS'та 4% PFA белән перфузия ясалды. Тукымалар 4°C температурада төнлә 4% PFA/PBS'та кисеп алынды һәм фиксацияләнде. PBS'та фиксацияләнгән мидән сагитталь кисемтәләрне (50 мкм калынлыкта) әзерләү өчен тибрәнү пычагы (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрия) кулланылды. Башкача күрсәтелмәгән булса, ирекле йөзүче кисемтәләрне буяу югарыда тасвирланганча (13) бүлмә температурасында башкарылды һәм болгатты. Кыскасы, башта алынган кисемтәләр 0,5% Triton X-100/PBS белән бүлмә температурасында 15 минут дәвамында үткәрелде; кайбер эпитоплар өчен (Pcx һәм Shmt2), 80°C температурада (PH 9) трис-ЭДТА буферында кисемтәләрне бу адым урынына 25 минут җылытыгыз. Аннары, кисемтәләр беренчел антитәнчек белән (S1 таблицасын карагыз) блоклаучы буферда (3% BSA/PBS) 4°C температурада төн буе болгатып инкубацияләнде. Икенче көнне, кисемтәләр блоклаучы буфер белән юылды һәм бүлмә температурасында 2 сәгать дәвамында тиешле флуорофор белән конъюгацияләнгән икенчел антитәнчек белән инкубацияләнде; ахырда, кисемтәләр PBSта яхшылап юылды, DAPI белән капма-каршы буялды, аннары микроскоп слайдында AquaPolymount белән фиксацияләнде.
Үрнәкне сурәтләү өчен ак яктылык лазеры һәм 405 диодлы ультрафиолет лазеры белән җиһазландырылган лазер сканерлаучы конфокаль микроскоп (TCS SP8-X яки TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) кулланылды. Флуорофорны кузгатып һәм сигналны гибрид детектор (HyDs) белән җыеп, LAS-X программасы Nyquist үрнәк алуга туры килә торган катламлы сурәтләрне эзлекле режимда җыю өчен кулланылды: санлы булмаган панельләр өчен бу бик динамик сигналлар (мәсәлән, соматик күзәнәкләрдә һәм дендритларда) mtYFP). BrightR режимында PN санын ачыклау өчен HyD кулланыгыз). Фонны киметү өчен 0,3 дән 6 нс га кадәр каплау кулланыла.
Сортланган күзәнәкләрнең реаль вакыт режимындагы сурәтләү. 1% B27 өстәмәсе һәм 0,5 мМ GlutaMax булган Neurobasal-A мохитендә сортлаганнан соң, күзәнәкләр шунда ук поли-l-лизин белән капланган пыяла слайдларга (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталог номеры 80826) чәчелде, аннары күзәнәкләр утырыр өчен аны 37°C температурада һәм 5% CO2 температурада 1 сәгать тотыгыз. Реаль вакыт режимындагы сурәтләү ак лазер, HyD, 63×[1,4 санлы диафрагма (NA)] майлы объектив һәм җылыту этабы белән җиһазландырылган Leica SP8 лазер сканерлаучы конфокаль микроскопта башкарылды.
Тычканга тиз арада углекислый газ анестезия ясалды һәм баш киселде, баш мие баш сөягеннән тиз арада алынды һәм 200 мкм калынлыкта (13C маркировкалау эксперименты өчен) яки 275 мкм калынлыкта (ике фотон эксперименты өчен) сагитталь кисемтәгә киселде, түбәндәге материаллар белән тутырылды. Туңдырма (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германия) түбәндәге матдәләр белән тутырылды: 125 мМ бозлы, углерод белән туендырылган (95% O2 һәм 5% CO2) аз Ca2 + ясалма баш мие сыекчасы (ACSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буферы, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкоза, 0,5 мМ CaCl2 һәм 3,5 мМ MgCl2 (осмотик басым 310 - 330 ммоль). Алынган ми кисәкләрен югарырак Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфаты буферы, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 һәм 2.0 мМ MgCl2) булган инкубация алдыннан камерага күчерегез. Уртача) рН 7.4 һәм 310 - 320 ммоль).
Рәсемләү процессы барышында кисәкләр махсус рәсемләү бүлмәсенә күчерелде, һәм эксперимент 32° - 33°C даими температурада өзлексез ACSF перфузиясе астында үткәрелде. Кисәкләр рәсеме өчен Leica 25x объектив линзасы (NA 0.95, су) белән җиһазландырылган күп фотонлы лазер сканерлау микроскобы (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), Ti: Sapphire лазеры (Chameleon Vision II, Coherent) кулланылды. FLIM модуле (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 FLIM. PNларның цитоплазматик редокс халәтендәге үзгәрешләр сагитталь ми кисәкләрендә ике фотонлы FLIM ярдәмендә үлчәнде, анда Grx1-roGFP2 биосенсоры PNларга юнәлтелгән иде. PN катламында, яшәүчән PN (ягъни, дендритлар буйлап муенса структурасы яки нейрон морфологик үзгәрешләр булмау) һәм икеләтә уңай roGFP2 сенсоры һәм shRNA PCx яки аның контроль эзлеклелеген кодлаучы AAV (һәрберсе mCherry белән бергә экспрессияләнә) булуын тәэмин итү өчен, кисәк өслегеннән якынча 50-80 мкм түбәнрәк алу кыры сайлана. 2х санлы зум белән бер катлы рәсемнәр җыегыз [кузгату дулкын озынлыгы: 890 нм; 512 нм 512 пиксель]. Детекторлау: эчке HyD, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) фильтр төркеме] һәм 2-3 минут эчендә уртача рәсемнәр кәкре туры китерү өчен җитәрлек фотоннар җыелуын (барлыгы 1000 фотон) тәэмин итү өчен кулланыла. Grx1-roGFP2 зондының сизгерлеге һәм FLIM шартларын тикшерү перфузия ACSFка экзоген 10 мМ H2O2 өстәгәндә (оксидлашуны максимальләштерү өчен, нәтиҗәдә гомер озынлыгы арту), аннары 2 мМ дитиотреитол өстәгәндә (редукция дәрәҗәсен минимальләштерә, нәтиҗәдә гомер озынлыгы кими) roGFP2 гомер озынлыгы кыйммәтен күзәтү юлы белән башкарылды (S8 нче рәсем, D дан G га кадәр). Алынган нәтиҗәләрне анализлау өчен FLIMfit 5.1.1 программасын кулланыгыз, бөтен рәсемнең бер экспоненциаль таркалу кәкресен үлчәнгән IRF га (инструмент җавап функциясе) туры китерегез, һәм χ2 якынча 1 гә тигез. Бер PN гомер озынлыгын исәпләү өчен, нерв тәне тирәсендәге битлек кул белән сызылды, һәм һәр битлекнең уртача гомер озынлыгы саннар өчен кулланылды.
Митохондриаль потенциал анализы. Кискен кисемтә перфузияләнгән ACSFка турыдан-туры өстәлгән 100 нМ TMRM белән 30 минут инкубацияләнгәннән соң, PNларның митохондриаль потенциал үзгәрешләре ике фотонлы микроскоп белән үлчәнде. TMRM сурәтләү зондны 920 нмда кузгату һәм сигналлар җыю өчен эчке HyD (тетраметилродамин изотиоцианаты: 585/40 нм) кулланып башкарылды; шул ук кузгату дулкын озынлыгын кулланып, ләкин mtYFP сурәтләү өчен башка эчке HyD (FITC:525/50) кулланып. Бер күзәнәк дәрәҗәсендә митохондриаль потенциалны бәяләү өчен ImageJ'ның Image Calculator плагинын кулланыгыз. Кыскасы, сигнал = мин (mtYFP, TMRM) тигезләмәсе Пуркинье Сомалидагы TMRM сигналын күрсәтүче митохондриаль өлкәне билгеләү өчен кулланыла. Аннары килеп чыккан битлектәге пиксель мәйданы санлаштырыла, аннары митохондриаль потенциалны күрсәтүче митохондриаль фракцияне алу өчен mtYFP каналының тиешле бусага бер катлы рәсемендә нормальләштерелә.
Рәсем Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) программасы ярдәмендә буталчыкланды. Плиткаларның сканерланган рәсемнәре өчен, бер плитканы монтажлау LAS-X программасы тарафыннан тәкъдим ителгән автоматик тегү алгоритмы ярдәмендә башкарыла. Рәсем калибрланганнан соң, рәсемне алга таба эшкәртү һәм яктылык һәм контрастны тигез көйләү өчен ImageJ һәм Adobe Photoshop кулланыгыз. График әзерләү өчен Adobe Illustrator кулланыгыз.
мтДНК фокус анализы. мтДНК җәрәхәтләре саны конфокаль микроскоп ярдәмендә ДНКга каршы антитәнчекләр белән билгеләнгән мичек кисемтәләрендә сан белән билгеләнде. Һәр максат өлкәсе күзәнәк тәне һәм һәр күзәнәкнең төше өчен булдырылды, һәм тиешле мәйдан Multi Measure плагины (ImageJ программасы) ярдәмендә исәпләнде. Цитоплазматик өлкәне алу өчен күзәнәк тәне өлкәсеннән төш өлкәсен алыгыз. Ниһаять, бусага рәсемендә мтДНКны күрсәтүче цитоплазматик ДНК нокталарын автоматик рәвештә сан белән билгеләү өчен Analyse Particles плагины (ImageJ программасы) кулланылды, һәм алынган нәтиҗәләр CTRL тычканнарының PN уртача күрсәткеченә нормальләштерелде. Нәтиҗәләр күзәнәктәге нуклеозидларның уртача саны буларак күрсәтелә.
Аксым экспрессиясен анализлау. ImageJ'ның Image Calculator плагинын кулланып, PN'дагы аксым экспрессиясен бер күзәнәк дәрәҗәсендә бәяләгез. Кыскасы, тиешле каналның бер катламлы конфокаль рәсемендә, сигнал = мин (mtYFP, антитәнчек) тигезләмәсе аша Пуркинадагы билгеле бер антитәнчеккә иммунореактивлык күрсәтүче митохондриаль өлкә билгеләнә. Аннары барлыкка килгән битлектәге пиксель мәйданы санлаштырыла, аннары күрсәтелгән аксымның митохондриаль өлешен алу өчен mtYFP каналының тиешле бусага бер катламлы рәсемендә нормальләштерелә.
Пуркинье күзәнәкләренең тыгызлыгын анализлау. ImageJ'ның күзәнәк санагычы плагины саналган Пуркинье күзәнәкләре санын саналган күзәнәкләр биләгән мичек боҗрасы озынлыгына бүлеп, Пуркинье тыгызлыгын бәяләү өчен кулланылды.
Үрнәк әзерләү һәм җыю. Контроль төркем һәм Mfn2cKO тычканнарының мие 0,1 М фосфат буферында (PB) 2% PFA/2,5% глутаральдегидта фиксацияләнде, аннары корональ кисемтәләр инфузорлар кулланып әзерләнде (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) (калынлыгы 50-60 мкм). Аннары PB буферында 1% os тетраоксидында һәм 1,5% калий ферроцианидында бүлмә температурасында 1 сәгатькә ныгытылды. Кисемтәләр өч тапкыр дистилляцияләнгән су белән юылды, аннары 20 минут дәвамында 1% уранил ацетатлы 70% этанол белән буялды. Аннары кисемтәләр сортланган спиртта киптерелде һәм кремний белән капланган пыяла слайдлар арасына Durcupan ACM (Araldite casting smola M) эпоксид сумаласына (Electron Microscopy Sciences, каталог номеры 14040) салынды, һәм ниһаять, 60°C температурада мичтә 48 сәгать полимерлаштырылды. Баш мие кабыгы өлкәсе сайланды һәм Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) аппаратында 50 нм ультранечкә кисемтәләр киселде һәм полистирол пленкасы белән капланган 2×1 мм бакыр ярыклы челтәрдә сайлап алынды. Кисемтәләр 10 минут дәвамында H2Oдагы 4% уранил ацетат эремәсе белән буялды, берничә тапкыр H2O белән юылды, аннары H2Oдагы Рейнольдс кургаш цитраты белән 10 минут юылды, аннары берничә тапкыр H2O белән юылды. Микрографлар Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, АКШ) трансмиссия электрон микроскобы белән TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 цифрлы камерасы (TVIPS GmbH, Гаутинг, АКШ) ярдәмендә алынды.
AAV белән зарарланган тычканнар өчен баш мие аерылды һәм 1 мм калынлыктагы сагитталь кисемтәгә киселде, ә минең мие флуоресценция микроскопы ярдәмендә AAV белән зарарланган боҗраны (ягъни mCherry экспрессиясен) ачыклау өчен тикшерелде. AAV инъекциясе кимендә ике рәттән минең мие боҗрасында Пуркинье күзәнәк катламының (ягъни бөтен катламның диярлек) бик югары трансдукция нәтиҗәлелегенә китергән экспериментлар гына кулланыла. AAV белән трансдукцияләнгән элмәк фиксациядән соң төнлә микродиссекцияләнде (0,1 М какаот буферында 4% PFA һәм 2,5% глутаральдегид) һәм алга таба эшкәртелде. EPON урнаштыру өчен, фиксацияләнгән тукыма 0,1 М натрий какаот буферы (Applichem) белән юылды һәм 0,1 М натрий какаот буферында (Applichem) 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) белән 4 сәгать инкубацияләнде, аннары 2 сәгать юылды. 0,1 М кокамид буферы белән 3 тапкыр кабатлагыз. Аннары, этанолның күтәрелүче сериясе тукымаларны сусызландыру өчен һәр этанол эремәсен 4°C температурада 15 минут инкубацияләү өчен кулланылды. Тукыма пропилен оксидына күчерелде һәм 4°C температурада EPON (Sigma-Aldrich) эчендә төнлә инкубацияләнде. Тукыманы бүлмә температурасында 2 сәгатькә яңа EPON эченә куегыз, аннары 62°C температурада 72 сәгатькә урнаштырыгыз. Ультрамикротом (Leica Microsystems, UC6) һәм алмаз пычагы (Diatome, Biel, Швейцария) ярдәмендә 70 нм ультранечкә кисемтәләрне кисегез, һәм 37°C температурада 15 минут дәвамында 1,5% уранил ацетат белән буягыз, һәм 4 минут дәвамында кургаш цитраты эремәсе белән буягыз. Электрон микрографлар Camera OneView 4K 16-битлы (Gatan) һәм DigitalMicrograph программа тәэминаты (Gatan) белән җиһазландырылган JEM-2100 Plus трансмиссия электрон микроскобы (JEOL) ярдәмендә төшерелде. Анализ өчен, 5000 × яки 10,000 × цифрлы зум белән электрон микрографлар алынды.
Митохондрияләрнең морфологик анализы. Барлык анализлар өчен дә аерым митохондрияләрнең контурлары ImageJ программасы ярдәмендә санлы рәсемнәрдә кул белән билгеләнде. Төрле морфологик параметрлар анализланды. Митохондрия тыгызлыгы һәр күзәнәкнең гомуми митохондрия мәйданын цитоплазма мәйданына бүлү юлы белән алынган процент рәвешендә күрсәтелә (цитоплазма мәйданы = күзәнәк мәйданы-күзәнәк ядросы мәйданы) × 100. Митохондрияләрнең түгәрәклеге [4π∙(мәйдан/периметр 2)] формуласы белән исәпләнә. Митохондрияләрнең иста морфологиясе анализланды һәм аларның төп формаларына карап ике категориягә ("төрле" һәм "күперчәк") бүленде.
Аутофагосома/лизосома саны һәм тыгызлык анализы. Санлы рәсемдә һәр аутофагосома/лизосоманың контурларын кул белән билгеләү өчен ImageJ программасын кулланыгыз. Аутофагосома/лизосома мәйданы һәр күзәнәкнең гомуми аутофагосома/лизосома структурасы мәйданын цитоплазма мәйданына бүлеп исәпләнгән процент рәвешендә күрсәтелә (цитоплазма мәйданы=күзәнәк мәйданы-төш мәйданы)×100. Аутофагосомаларның/лизосомаларның тыгызлыгы гомуми санны күзәнәктәге аутофагосома/лизосома структуралары санына бүлеп исәпләнә (цитоплазма мәйданы буенча) (цитоплазма мәйданы = күзәнәк мәйданы-төш мәйданы).
Кискен кисемтә һәм үрнәк әзерләү өчен маркировкалау. Глюкоза маркировкасын таләп итә торган экспериментлар өчен, кискен баш мие кисәкләрен инкубация алдыннан камерага күчерегез, анда туендырылган углерод (95% O2 һәм 5% CO2), югары Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфаты буферы, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 һәм 2.0 мМ MgCl2, рН 7.4 һәм 310 - 320 мОсм га көйләнгән) бар, анда глюкоза 13C6- Глюкозаны алыштыру (Eurisotop, каталог номеры CLM-1396). Пируватны билгеләүне таләп итә торган экспериментлар өчен, кискен ми кисәкләрен югарырак Ca2 + ACSFка күчерегез (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфаты буферы, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 һәм 2.0 мМ MgCl2 өстәгез, pH 7.4 һәм 310 дан 320 мОсм га кадәр көйләгез) һәм 1 мМ 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталог номеры CLM-1082) өстәгез. Кисемтәләрне 37°C температурада 90 минут инкубацияләгез. Эксперимент ахырында кисемтәләрне тиз арада 75 мМ аммоний карбонаты булган сулы эремә (pH 7.4) белән юыгыз, аннары 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрилда (ACN): метанолда: суда гомогенлаштырыгыз. Кисемтәләр бозда 30 минут инкубацияләнгәннән соң, үрнәкләр 21,000 г авырлыкта 4°C температурада 10 минут центрифугаланды, ә үтә күренмәле өслек катламы SpeedVac концентраторында киптерелде. Нәтиҗәдә киптерелгән метаболит грануласын анализга кадәр -80°C температурада сакладылар.
13 С-тамгалы аминокислоталарның сыек хроматография-масса-спектрометрия анализы. Сыек хроматография-масса-спектрометрия (LC-MS) анализы өчен метаболит грануласын 75 мкл LC-MS класслы суда (Honeywell) яңадан эреттеләр. 21,000 г температурада 4°C температурада 5 минут центрифугалаганнан соң, аминокислота агымын анализлау өчен 20 мкл ачыкланган өслек катламы кулланылды, ә экстрактның калган өлеше шунда ук анион анализы өчен кулланылды (түбәндә карагыз). Аминокислота анализы элек тасвирланган бензоилхлорид дериватизациясе протоколы буенча башкарылды (55, 56). Беренче адымда 20 мкл метаболит экстрактына 10 мкл 100 мМ натрий карбонаты (Sigma-Aldrich) өстәлде, аннары LC класслы ACNга 10 мкл 2% бензоилхлорид (Sigma-Aldrich) өстәлде. Үрнәк кыска вакытка вортексланды, аннары 21,000 g тизлектә 20°C температурада 5 минут дәвамында центрифугаланды. Чистартылган өслек катламын конуссыман пыяла өстәмәле (200 мкл күләмдә) 2 мл автосамплер флаконына күчерегез. Үрнәкләр Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) югары сыйфатлы төгәл масса-спектрометрына (Thermo Fisher Scientific) тоташтырылган Acquity iClass ультра югары җитештерүчәнлекле LC системасы (Waters) ярдәмендә анализланды. Анализ өчен, алынган үрнәкнең 2 мкл 1,8 мкм кисәкчәләрне үз эченә алган 100 × 1,0 мм зурлыктагы югары ныклыклы кремний диоксиды T3 колонкасына (Waters) кертелде. Агым тизлеге 100 мкл/мин, һәм буфер системасы A буферыннан (10 мМ аммоний форматы һәм судагы 0,15% кубыз кислотасы) һәм B буферыннан (ACN) тора. Градиент түбәндәгечә: 0 минутта 0%B; 0%B. 0 дән 0,1 минутка кадәр 0 - 15% B; 0,1 дән 0,5 минутка кадәр 15 - 17% B; 0,5 - 14 минутка кадәр 17 - 55%; 14 - 14,5 минутка кадәр 55 - 70%; 14,5 - 70 - 100% B 18 минутка кадәр; 100% B 18 - 19 минутка кадәр; 100 - 0% B 19 - 19,1 минутка кадәр; 0% B 19,1 - 28 минутка кадәр (55, 56). QE-HF масса-спектрометры m/z (масса/заряд нисбәте) масса диапазоны 50 дән 750 гә кадәр уңай ионлашу режимында эшли. Кулланылган чишелеш 60,000, һәм алынган көчәйтү контроле (AGC) ион максаты 3×106, һәм максималь ион вакыты 100 миллисекунд. Җылытылган электроспрей ионлашу (ESI) чыганагы 3,5 кВ сиптерү көчәнешендә, капилляр температурасы 250°C, тышча һава агымы 60 AU (ихтыяри берәмлекләр) һәм ярдәмче һава агымы 20 AU. 250°C белән эшли. S линзасы 60 AU итеп куелган.
13C тамгаланган органик кислоталарның анион хроматографиясе-MS анализы. Калган метаболит чөкмәсе (55 мкл) QE-HF масса-спектрометрына (Thermo Fisher Scientific) тоташтырылган Dionex ион хроматография системасы (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ярдәмендә анализланды. Кыскасы, 5 мкл метаболит экстракты HPLC (2 мм × 250 мм, кисәкчәләр зурлыгы 4 мкм, Thermo Fisher Scientific) белән җиһазландырылган Dionex IonPac AS11-HC колоннасына 1 тутыру нисбәте белән бастырып кертелгән өлешчә цикл режимында кертелде.) Dionex IonPac AG11-HC саклагыч колоннасы (2 мм x 50 мм, 4 мкм, Thermo Fisher Scientific). Колонна температурасы 30°C температурада тотыла, ә автосамплер 6°C ка көйләнгән. Элюент генераторы аша калий гидроксиды градиентын булдыру өчен деионизацияләнгән су белән тәэмин ителгән калий гидроксиды картриджын кулланыгыз. Метаболитларны 380 мкл/мин агым тизлегендә аеру, түбәндәге градиентны куллану: 0-3 минут, 10 мМ KOH; 3-12 минут, 10-50 мМ KOH; 12-19 минут, 50-100 мМ KOH; 19-21 минут, 100 мМ KOH; 21-21,5 минут, 100-10 мМ KOH. Колонна 10 мМ KOH астында 8,5 минут дәвамында яңадан тигезләнде.
Элюцияләнгән метаболитлар колоннадан соң 150 мкл/мин изопропанол өстәмә агымы белән кушыла, аннары тискәре ионлашу режимында эшләүче югары ачыклыклы масса-спектрометрга юнәлтелә. MS масса диапазонын m/z 50 дән 750 гә кадәр 60,000 ачыклык белән күзәтә. AGC 1 × 106 га көйләнгән, һәм максималь ион вакыты 100 мс саклана. Җылытылган ESI чыганагы 3,5 кВ сиптерү көчәнешендә эшләде. Ион чыганагының башка көйләүләре түбәндәгечә: капилляр температурасы 275°C; тышча газы агымы, 60 AU; ярдәмче газ агымы, 300°C да 20 AU, һәм S линзасы 60 AU га көйләнгән.
13C тамгаланган метаболитларның мәгълүмат анализы. Изотоп нисбәте мәгълүматларын анализлау өчен TraceFinder программасын (4.2 версиясе, Thermo Fisher Scientific) кулланыгыз. Һәр кушылманың үзенчәлеге ышанычлы белешмә кушылма белән тикшерелде һәм мөстәкыйль рәвештә анализланды. Изотопларны баету анализын үткәрү өчен, һәр 13C изотопының (Mn) алынган ион хроматограммасы (XIC) мәйданы [M + H]+ дан алынды, монда n - максатлы кушылманың углерод саны, ул аминокислоталарны анализлау өчен кулланыла яки [MH]+ анионнарны анализлау өчен кулланыла. XIC масса төгәллеге миллионга биш өлештән кимрәк, ә RT төгәллеге 0,05 минут. Баету анализы һәр ачыкланган изотопның тиешле кушылманың барлык изотоплары суммасына нисбәтен исәпләү юлы белән башкарыла. Бу нисбәтләр һәр изотоп өчен процент кыйммәтләре буларак бирелә, һәм нәтиҗәләр моляр процент баету (MPE) буларак күрсәтелә, алдан тасвирланганча (42).
Туңдырылган нейрон грануласын бозлы 80% метанолда (к/к) гомогенлаштырдылар, вортексладылар һәм -20°C температурада 30 минут инкубацияләделәр. Үрнәкне тагын бер тапкыр вортекслагыз һәм +4°C температурада 30 минут болгатыгыз. Үрнәк 21000 г температурада 4°C температурада 5 минут центрифугаланды, аннары барлыкка килгән өслек катламы җыелды һәм алга таба анализ өчен 25°C температурада SpeedVac концентраторы ярдәмендә киптерелде. Югарыда тасвирланганча, сортланган күзәнәкләрнең аминокислоталарында LC-MS анализы үткәрелде. TraceFinder (4.2 версиясе, Thermo Fisher Scientific) кулланып, һәр кушылманың моноизотоп массасын кулланып мәгълүмат анализы үткәрелде. Метаболит мәгълүматларын квантиль нормальләштерү preprocessCore программа пакеты (57) ярдәмендә башкарылды.
Кисәк әзерләү. Тычкан тиз арада углекислый газ белән наркозланды һәм баш киселде, баш мие тиз арада баш сөягеннән алынды, һәм боз белән тутырылган тибрәнү пычагы (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германия) ярдәмендә аны 300 дән 375 мкм га кадәр сагитталь кисемнәргә кистеләр. Салкын углерод газификациясе (95% O2 һәм 5% CO2) Түбән Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфаты буферы, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 һәм 6.0 мМ MgCl2 pH 7.4 һәм 310 нан 330 мОсм га кадәр көйләгез). Алынган ми кисәкләрен югарырак Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфаты буферы, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 4.0 мМ CaCl2 һәм мМ 3.5 MgCl2) рН 7.4 һәм 310 - 320 мОсм булган камерага күчерегез. Кисәкләрне яздыру алдыннан торгызып була торган итеп 20-30 минут саклагыз.
яздыру. Барлык яздырулар өчен дә фиксацияләнгән яздыру камерасы һәм 20 тапкыр суга батыру объектив линзасы (Scientifica) белән җиһазландырылган микроскоп баскычы кулланылды. Күзәнәкле Пуркинье күзәнәкләре (i) тән зурлыгы, (ii) мичәкнең анатомик урнашуы һәм (iii) флуоресцент mtYFP репортер генының экспрессиясе буенча билгеләнде. Оч каршылыгы 5-11 мегом булган патч пипетка боросиликат пыяла капилляр (GB150-10, 0,86 мм×1,5 мм×100 мм, Science Products, Хофхайм, Германия) һәм горизонталь пипетка Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA ярдәмендә тартып чыгарыла. Барлык яздырулар да Signal программа тәэминаты (6.0 версиясе, Cambridge Electronic, Cambridge, Бөекбритания) белән идарә ителгән ELC-03XS npi патч кыскыч көчәйткече (npi electronic GmbH, Tam, Германия) ярдәмендә башкарылды. Эксперимент 12,5 кГц үрнәк алу ешлыгында язып алынды. Сигнал ике кыска ешлыклы Бессель фильтры белән фильтрлана, аларның кисү ешлыгы 1,3 һәм 10 кГц тәшкил итә. Мембрана һәм пипетка сыйдырышлыгы көчәйткеч ярдәмендә компенсация схемасы белән компенсацияләнә. Барлык экспериментлар да Hokawo программасы белән идарә ителгән Orca-Flash 4.0 камерасы (Hamamatsu, Gerden, Германия) контролендә үткәрелде (2.8 версиясе, Hamamatsu, Gerden, Германия).
Гадәти бөтен күзәнәк конфигурациясе һәм анализы. Яздыру алдыннан пипеткага түбәндәге матдәләрне үз эченә алган эчке эремә тутырыгыз: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ калий глюконаты, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ ATP (Mg), 0,5 мМ Гуанозин трифосфаты (GTP) (Na) һәм 10,0 мМ креатинин фосфаты рН 7,25кә кадәр көйләнде, ә осмотик басым 290 мОсм (сахароза) булды. Мембрананы яру өчен 0 пА көч кулланганнан соң, тыныч мембрана потенциалы үлчәнде. Керү каршылыгы -40, -30, -20 һәм -10 пА гиперполяризацияләнгән ток кулланып үлчәнә. Көчәнеш җавабының зурлыгын үлчәгез һәм керү каршылыгын исәпләү өчен Ом законын кулланыгыз. Үзеннән-үзе активлык көчәнеш кыскычында 5 минут дәвамында теркәлде, һәм sPSC Igor Pro (32 7.01 версиясе, WaveMetrics, Лейк Освего, Орегон, АКШ) программасында ярым-автоматик тану скрипты ярдәмендә ачыкланды һәм үлчәнде. IV кәкресе һәм тотрыклы хәл ток батареяны төрле потенциалларда (-110 мВ дан башлап) кысып һәм көчәнешне 5 мВ адымнар белән арттырып үлчәнә. AP җитештерү деполяризацияләүче ток кулланып тикшерелде. Деполяризацияләүче ток импульсын кулланып, күзәнәкне -70 мВ га кысыгыз. Һәр теркәү берәмлегенең адым зурлыгын аерым көйләгез (10 нан 60 пА га кадәр). Иң югары AP ешлыгына китерә торган импульс сикерешләрен кул белән санап, максималь AP ешлыгын исәпләгез. AP бусагасы бер яки берничә AP ны беренче тапкыр эшләтеп җибәрә торган деполяризация импульсының икенче чыгарылмасын кулланып анализлана.
Перфорацияләнгән патч конфигурациясе һәм анализы. Стандарт протоколлар кулланып, перфорацияләнгән патч яздыруын башкарыгыз. Түбәндәге ингредиентларны үз эченә алмаган АТФ һәм ГТФсыз пипетка кулланыгыз: 128 мМ глюконат К, 10 мМ KCl, 10 мМ Гепес, 0,1 мМ EGTA һәм 2 мМ MgCl2 һәм рН 7,2 гә кадәр көйләгез (KOH кулланып). Күзәнәк мембранасының контрольсез үткәрүчәнлеген булдырмас өчен, АТФ һәм ГТФ күзәнәк эчендәге эремәдән чыгарыла. Патч пипеткасына амфотерицинлы эчке эремә (якынча 200 - 250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich) тутырыла, тишелгән патч язмасы алына. Амфотерицин диметилсульфоксидта эретелә (соңгы концентрация: 0,1 - 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Кулланылган DMSO концентрациясе өйрәнелгән нейроннарга әһәмиятле йогынты ясамады. Тишеп алу процессы барышында канал каршылыгы (Ra) өзлексез күзәтелде, һәм Ra һәм AP амплитудасы тотрыклыланганнан соң (20-40 минут) эксперимент башланды. Үзеннән-үзе активлык көчәнеш һәм/яки ток кыскычында 2 дән 5 минутка кадәр үлчәнә. Мәгълүматлар анализы Igor Pro (7.05.2 версиясе, WaveMetrics, АКШ), Excel (2010 версиясе, Microsoft Corporation, Редмонд, АКШ) һәм GraphPad Prism (8.1.2 версиясе, GraphPad Software Inc., Ла-Холья, Калифорния) кулланып башкарылды. Үзеннән-үзе барлыкка килгән APларны ачыклау өчен, IgorPro'ның NeuroMatic v3.0c плагины кулланыла. Һәр язма өчен аерым көйләнә торган бирелгән чикне кулланып, APларны автоматик рәвештә ачыклагыз. Тишеп алу интервалын кулланып, максималь тизлекле тишеп алу ешлыгы һәм уртача тишеп алу ешлыгы белән тишеп алу ешлыгын билгеләгез.
PN изоляциясе. Элегрәк бастырылган протоколга яраклашып, PNлар тычкан миеннән билгеләнгән этапта чистартылды (58). Кыскасы, мичек бозлы диссоциация мохитендә [HBSS Ca2+ һәм Mg2+ булмаган, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 U/мл) һәм стрептомицин (0,05 мг/мл) белән тулыландырылган] аерылды һәм вакланды, аннары мохит папаин эчендә эшкәртелде [HBSS, 1-цистеин·HCl (1 мг/мл), папаин (16 U/мл) һәм дезоксирибонуклеаза I (DNase I; 0,1 мг/мл) белән тулыландырылды]. 30°C температурада 30 минут дәвамында эшкәртелде. Башта тукымаларны йомырка лайласы (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) һәм DNase (0,1 мг/мл) булган HBSS мохитендә бүлмә температурасында юыгыз, ферментатив эшкәртүне булдырмас өчен, аннары 20 мМ глюкоза булган HBSS мохитендә HBSS, пенициллин (50 U/мл), стрептомицин (0,05 мг/мл) һәм DNase (0,1 мг/мл) белән йомшак итеп тарттырыгыз, аерым күзәнәкләрне чыгарыгыз. Нәтиҗәдә барлыкка килгән күзәнәк суспензиясе 70 мкм күзәнәк сөзгече аша фильтрланды, аннары күзәнәкләр центрифугалау (1110 әйләнү/мин, 5 минут, 4°C) ярдәмендә бөртекләнде һәм сортлау мохитендә кабат суспензияләнде [HBSS, 20 мМ глюкоза, 20% феталь сыер сыеры) сывороткасы, пенициллин (50 U/мл) һәм стрептомицин (0,05 мг/мл) белән тулыландырылды]; күзәнәкнең яшәүчәнлеген пропидий йодиды белән бәяләгез һәм күзәнәк тыгызлыгын 1 × 106 - 2 × 106 күзәнәк/мл кадәр көйләгез. Агым цитометриясе алдыннан суспензия 50 мкм күзәнәк сүзгече аша фильтрланды.
Агым цитометры. Күзәнәкләрне сортлау 4°C температурада FACSAria III машинасы (BD Biosciences) һәм FACSDiva программа тәэминаты (BD Biosciences, 8.0.1 версиясе) ярдәмендә башкарылды. Күзәнәк суспензиясе 100 мкм насадка ярдәмендә 20 psi басым астында ~2800 вакыйга/сек тизлегендә сортланды. Традицион каплау критерийлары (күзәнәк зурлыгы, бимодаль аерма һәм таралу үзенчәлекләре) PNны башка күзәнәк төрләреннән дөрес изоляцияләүне тәэмин итә алмаганлыктан, каплау стратегиясе mitoYFP+ ​​​​һәм контроль mitoYFP − Тычканнарында YFP интенсивлыгын һәм автофлуоресценциясен турыдан-туры чагыштыруга нигезләнеп билгеләнә. YFP үрнәкне 488 нм лазер сызыгы белән нурландыру юлы белән кузгатыла, һәм сигнал 530/30 нм полосалы фильтр ярдәмендә ачыклана. mitoYFP+ ​​тычканнарында Rosa26-mitoYFP репортер генының чагыштырма көче нейрон тәнен һәм аксон фрагментларын аеру өчен дә кулланыла. 7-AAD 561 нм сары лазер белән кузгатыла һәм үле күзәнәкләрне чыгару өчен 675/20 нм тасмалы фильтр белән ачыклана. Астроцитларны аеру өчен, бер үк вакытта күзәнәк суспензиясе ACSA-2-APC белән буялды, аннары үрнәк 640 нм лазер сызыгы белән нурландырылды, һәм сигналны ачыклау өчен 660/20 нм тасмалы фильтр кулланылды.
Җыелган күзәнәкләр центрифугалау ярдәмендә бөртекләнгән (1110 әйләнү/мин, 5 минут, 4°C) һәм кулланылганчы -80°C температурада сакланган. Процедуралы үзгәрүчәнлекне минимальләштерү өчен Mfn2cKO тычканнары һәм аларның балалары бер үк көнне классификацияләнгән. FACS мәгълүматларын тәкъдим итү һәм анализлау FlowJo программа тәэминаты (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ярдәмендә башкарылган.
Югарыда әйтелгәнчә (59), реаль вакытлы ПЦР ДНКны сортланган нейроннардан аерып алу өчен кулланыла, аннары мтДНКны санлаштыру өчен. Сызыклылык һәм бусага сизгерлеге башта төрле санлы күзәнәкләрдә qPCR кулланып тикшерелде. Кыскасы, 50 мМ трис-HCl (рН 8.5), 1 мМ EDTA, 0.5% Tween 20 һәм протеиназа K (200 нг/мл) дан торган лизис буферында 300 PN җыегыз һәм 55°C температурада 120 минут инкубацияләгез. Протеиназа K тулысынча инактивлашуын тәэмин итү өчен күзәнәкләр 95°C температурада 10 минут инкубацияләнде. mt-Nd1 өчен махсус TaqMan зондын (Thermo Fisher) кулланып, мтДНК 7900HT Real-Time ПЦР системасында (Thermo Fisher Scientific) ярымсанлы ПЦР ярдәмендә үлчәнде. Science, каталог номеры Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталог номеры AIVI3E8) һәм 18S (Thermo Fisher Scientific, каталог номеры Hs99999901_s1) геннары.
Протеом үрнәген әзерләү. Эремәне 95°C температурада 10 минут җылытып һәм ультрадыбыс белән лизис буферында [6 М гуанидин хлориды, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлориды, 10 мМ хлорацетамид һәм 100 мМ трис- туңдырылган нейрон гранулаларын HCl эчендә лизислау]. Биорупторда (Диагенод) 10 минут дәвамында (30 секунд импульс / 30 секунд пауза чоры). Үрнәк 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эремәсендә 1:10 сыекландырылды, 300 нг трипсин алтыны (Promega) белән кушылды һәм тулысынча эшкәртелүгә ирешү өчен 37°C температурада төнлә инкубацияләнде. Икенче көнне үрнәк 20,000 г температурада 20 минут дәвамында центрифугаланды. Өслек катламы 0,1% кумурска кислотасы белән сыекландырылды, һәм эремә үз-үзең ясаган StageTips белән тозсызландырылды. Үрнәк SpeedVac коралында (Eppendorf концентраторы плюс 5305) 45°C температурада киптерелде, аннары пептид 0,1% кумурска кислотасында суспензияләнде. Барлык үрнәкләр дә бер үк кеше тарафыннан бер үк вакытта әзерләнде. Астроцит үрнәкләрен анализлау өчен, 4 мкг тозсызландырылган пептидлар тандем массасы этикеткасы (TMT10plex, каталог номеры 90110, Thermo Fisher Scientific) белән пептидның TMT реактивына нисбәте 1:20 иде. TMT маркировкасы өчен, 0,8 мг TMT реактивы 70 мкл сусыз ACNда яңадан суспензияләнде, һәм киптерелгән пептид 9 мкл 0,1 M TEAB (триэтиламмоний бикарбонаты) га әйләндерелде, аңа ACNдагы 7 мкл TMT реактивы өстәлде. Концентрация 43,75% тәшкил итте. 60 минут инкубациядән соң, реакция 2 мкл 5% гидроксиламин белән сүндерелде. Билгеләнгән пептидлар җыелды, киптерелде, 200 мкл 0,1% корыч кислотасында (FA) кабат эретелде, икегә бүленде, аннары үзебез ясаган StageTips ярдәмендә тозсызландырылды. UltiMate 3000 ультра югары нәтиҗәле сыек хроматографын (UltiMate 3000 ультра югары нәтиҗәле сыек хроматограф) кулланып, ике яртының берсе 130Å1,7μm C18 кисәкчәләре белән тутырылган 1мм x 150мм Acquity хроматографик колонкасында фракцияләнде (Waters, каталог № SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Пептидларны 30 мкл/мин агым тизлегендә аерыгыз, 1% тан 50% ка кадәр буфер B дан 85 минутка аерыгыз, 96 минутлык баскычлы градиент белән, 50% тан 95% ка кадәр буфер B дан 3 минутка, аннары 95% буфер B өчен 8 минут тотыгыз; A буферы 5% ACN һәм 10 мМ аммоний бикарбонаты (ABC), ә B буферы 80% ACN һәм 10 мМ ABC дан тора. Фракцияләрне һәр 3 минут саен җыеп, ике төркемгә берләштерегез (1 + 17, 2 + 18 һ.б.) һәм вакуум центрифугасында киптерегез.
LC-MS/MS анализы. Масса-спектрометрия өчен пептидлар (r119.aq номеры) 25 см, 75 мкм эчке диаметрлы PicoFrit аналитик колонкасында (яңа объектив линза, деталь номеры PF7508250) 1,9 мкм ReproSil-Pur 120 C18-AQ мохите (Dr. Maisch, mat) белән җиһазландырылган, Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Германия) кулланылган. Колонна 50°C температурада тотылды. А һәм В буферлары суда 0,1% формик кислотасыннан һәм 80% ACNда 0,1% формик кислотасыннан тора. Пептидлар 6% тан 31% ка кадәр B буферыннан 65 минутка һәм 31% тан 50% ка кадәр B буферыннан 5 минутка 200 нл/мин градиент белән аерылды. Элюцияләнгән пептидлар Orbitrap Fusion масса-спектрометрында (Thermo Fisher Scientific) анализланды. Пептид прекурсоры m/z үлчәү 350 дән 1500 м/з диапазонында 120,000 ачыклык белән башкарылды. 27% нормальләштерелгән бәрелеш энергиясен кулланып, югары энергияле C-тозак диссоциациясе (HCD) бүленеше өчен 2 дән 6 га кадәр заряд халәтендәге иң көчле прекурсор сайлана. Цикл вакыты 1 с итеп билгеләнде. Пептид фрагментының m/z кыйммәте ион тозагында иң кечкенә AGC максаты 5 × 104 һәм максималь инъекция вакыты 86 мс кулланып үлчәнде. Фрагментациядән соң, прекурсор 45 с динамик чыгару исемлегенә кертелде. TMT белән билгеләнгән пептидлар 50 см, 75 мкм Acclaim PepMap колонкасында (Thermo Fisher Scientific, каталог номеры 164942) аерылды, ә миграция спектрлары югары кырлы асимметрик дулкын формасы ионнары (FAIMS) җиһазлары (Thermo Fisher Scientific) белән җиһазландырылган Orbitrap Lumos Tribrid масса-спектрометрында (Thermo Fisher Scientific) анализланды, ул −50 һәм −70 В ике компенсация көчәнешендә эшли. Синхронизация прекурсоры нигезендә сайланган MS3 TMT отчеты ион сигналын үлчәү өчен кулланыла. Пептидларны аеру EASY-nLC 1200 җайланмасында 90% сызыклы градиент элюциясе кулланып, буфер концентрациясе 6% тан 31% ка кадәр булган вакытта башкарылды; A буферы 0,1% FA, ә B буферы 0,1% FA һәм 80% ACN иде. Аналитик колонка 50°C температурада эшли. FAIMS компенсация көчәнешенә карап, оригиналь файлны бүлү өчен FreeStyle (1.6 версиясе, Thermo Fisher Scientific) кулланыгыз.
Аксымны идентификацияләү һәм санлаштыру. Интегральләштерелгән Andromeda эзләү системасын кулланып, башлангыч мәгълүматлар MaxQuant 1.5.2.8 версиясе (https://maxquant.org/) ярдәмендә анализланды. Aequorea victoria'дан алынган Cre рекомбиназа һәм YFP эзлеклелекләреннән тыш, пептид фрагментлары спектрларында тычкан белешмә протеомының каноник эзлеклелеге һәм изоформа эзлеклелеге эзләнде (Proteome ID UP000000589, UniProt'тан 2017 елның маенда йөкләнгән). Метионин оксидлашуы һәм аксымның N-терминаль ацетиллашуы үзгәрүчән модификацияләр буларак билгеләнде; цистеин карбамоил метиллашуы фиксацияләнгән модификацияләр буларак билгеләнде. Ашказаны параметрлары "спецификлык" һәм "трипсин/P" дип билгеләнде. Аксымны идентификацияләү өчен кулланылган пептидлар һәм пептидларның минималь саны - 1; уникаль пептидларның минималь саны - 0. Пептид картасы туры килү шартларында аксым идентификацияләү тизлеге 0,01 иде. "Икенче пептид" варианты кушылган. Төрле оригиналь файллар арасында уңышлы идентификацияләрне күчерү өчен "эшләүләр арасында туры килү" опциясен кулланыгыз. Ярлыксыз санлаштыру (LFQ) өчен LFQ минималь коэффициенты саны 1 кулланыгыз (60). LFQ интенсивлыгы һәр вакыт ноктасында кимендә бер генотип төркемендә кимендә ике дөрес кыйммәт өчен фильтрлана һәм киңлеге 0,3 булган һәм 1,8 аска төшкән нормаль бүленештән экстраполяцияләнә. LFQ нәтиҗәләрен анализлау өчен Perseus исәпләү платформасын (https://maxquant.net/perseus/) һәм R (https://r-project.org/) кулланыгыз. Дифференциаль экспрессия анализы өчен limma программа пакетыннан ике яклы уртача t тесты кулланылды (61). Эзләнү мәгълүматлары анализы ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally һәм pheatmap кулланып башкарыла. TMT нигезендәге протеомика мәгълүматлары MaxQuant 1.6.10.43 версиясе ярдәмендә анализланды. UniProt кеше протеомикасы мәгълүмат базасыннан чимал протеомика мәгълүматларын эзләгез, ул 2018 елның сентябрендә йөкләнгән. Анализ җитештерүче тарафыннан бирелгән изотоп сафлыгын төзәтү коэффициентын үз эченә ала. Дифференциаль экспрессия анализы өчен R телендә limma кулланыгыз. Башлангыч мәгълүматлар, мәгълүмат базасын эзләү нәтиҗәләре һәм мәгълүмат анализы эш агымы һәм нәтиҗәләре барысы да PXD019690 мәгълүмат җыелмасы идентификаторы белән PRIDE партнер репозиторийы аша ProteomeXchange альянсында саклана.
Функциональ аннотацияләр анализны баета. 8 атналык мәгълүматлар җыелмасының функциональ аннотация терминнарының байлыгын билгеләү өчен Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) коралы кулланылды (1 нче рәсем). Кыскасы, LC-MS/MS (тандем масса-спектрометрия) мәгълүмат анализыннан алынган санлы аксымнар исемлеге түбәндәге фильтр критерийлары белән кулланыла: Mus musculus төр һәм фон буларак сайлана, һәм категориядә Benjaminini тарафыннан 0,05 яки аннан да түбәнрәк баету өчен көйләнгән P кыйммәте әһәмиятле дип санала. Бу график өчен һәр кластердагы көйләнгән P кыйммәтенә нигезләнгән иң яхшы биш артык категория күрсәтелгән. Күп санлы t-тест кулланып, Benjaminini, Krieger һәм Yekutieli (Q = 5%) ике этаплы сызыклы көчәйтү программасын кулланып, һәр категориядә билгеләнгән мөһим кандидатлар буенча вакыт-курс аксым экспрессиясе анализы үткәрелә, һәм һәр юл аерым анализлана. Эзлекле SD кабул итәргә кирәк түгел.
Бу тикшеренү нәтиҗәләрен бастырылган мәгълүмат базалары белән чагыштыру һәм 1 нче рәсемдә Венн диаграммасын булдыру өчен, без санлы аксым исемлеген MitoCarta 2.0 аннотацияләре белән берләштердек (24). Диаграмманы булдыру өчен Draw Venn Diagram онлайн коралын (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) кулланыгыз.
Протеомика анализы өчен кулланылган статистик процедуралар турында тулырак мәгълүмат алу өчен, зинһар, "Материаллар һәм методлар" бүлегенә мөрәҗәгать итегез. Башка барлык экспериментлар өчен тулырак мәгълүматны тиешле легендада табарга мөмкин. Башкача күрсәтелмәгән очракта, барлык мәгълүматлар уртача ± SEM буларак күрсәтелә, һәм барлык статистик анализлар GraphPad Prism 8.1.2 программасы ярдәмендә башкарылды.
Бу мәкалә өчен өстәмә материаллар белән танышу өчен, зинһар, http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 сылтамасын карагыз.
Бу - Creative Commons Attribution-Nocommercial License шартлары нигезендә таратылган ачык керү мөмкинлеге булган мәкалә, ул теләсә нинди материалда кулланырга, таратырга һәм күчереп алырга мөмкинлек бирә, ләкин соңгы куллану коммерция максатларында булмаган һәм төп эш дөрес булган очракта. Сылтама.
Искәрмә: Без сездән электрон почта адресыгызны гына сорыйбыз, шуңа күрә сез биткә тәкъдим иткән кеше сезнең электрон хатны күрүен теләвегезне һәм аның спам түгеллеген белсен. Без бернинди электрон почта адресларын да теркәмәячәкбез.
Бу сорау сезнең кунак булу-булмавыгызны тикшерү һәм спамның автоматик рәвештә җибәрелүен булдырмау өчен кулланыла.
Э. Мотори, И.Атанассов, СМВ Кочан, К.Фольц-Донаху, В.Сактивелу, П. Дживалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.Г. Ларсон
Дисфункциональ нейроннарның протеомика анализы метаболик программаларның нейродегенерациягә каршы тору өчен активлашуын күрсәтте.
Э. Мотори, И.Атанассов, СМВ Кочан, К.Фольц-Донаху, В.Сактивелу, П. Дживалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.Г. Ларсон
Дисфункциональ нейроннарның протеомика анализы метаболик программаларның нейродегенерациягә каршы тору өчен активлашуын күрсәтте.
© 2020 Фән үсеше өчен Америка Ассоциациясе. барлык хокуклар сакланган. AAAS - HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef һәм COUNTER партнеры. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.