Хәзерге†Агымдагы адрес: OX11 0DE, Бөекбритания, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Оксфордшир, Бөекбритания, Diamond Light Source Co., Ltd., Электрон биологик сурәтләү үзәге.
Реакция үзәгенең яктылык җыю комплексы 1 (RC-LH1) - шәмәхә фототрофик бактерияләрнең төп фотосинтетик компоненты. Без Rhodopseudomonas palustris'тан RC-LH1 комплексының ике криоэлектрон микроскопия структурасын керттек. RC-LH114-W комплексының 2.65-Å чишелеш структурасы RC тирәли урнашкан 14 LH1 субберәмлегеннән тора, ул W аксымы белән өзелә, ә W аксымы булмаган комплекс тулысынча RC составы белән уратып алынган. 16 субберәмлек LH1 элмәге ябык. Бу структураларны чагыштыру RC-LH1 комплексындагы хинон динамикасы турында мәгълүмат бирә, шул исәптән RC QB урынында хинон белән бәйләнгәндә элек билгеләнмәгән конформация үзгәрешләре, шулай ук ​​аларны RC'га үткәрергә ярдәм итүче ярдәмче хинон бәйләү урыннарының урнашуы. W аксымының уникаль структурасы LH1 элмәгенең ябылуына комачаулый, шуның белән хинон/хинолон алмашуын тизләтү өчен канал булдыра.
Фотосинтез белән бирелгән энергия җирдәге барлык тереклекне диярлек тәэмин итә ала, һәм аның кояш биотехнологиясе өчен зур потенциалы бар. Глобаль фотосинтезны алга этәрү белән беррәттән, шәмәхә фототрофик бактерияләр төрле энергия режимнарын һәм метаболик мөмкинлекләрне дә күрсәтәләр. Алар фотосинтездан кача алалар һәм караңгыда гетеротрофик бактерияләр буларак үсә алалар, азот һәм углекислый газны фиксацияли алалар, водород җитештерә алалар һәм ароматик кушылмаларны таркаталар (1-3). Бу процесслар өчен энергия бирү өчен яктылык тиз һәм нәтиҗәле рәвештә химик энергиягә әйләндерелергә тиеш. Бу процесс яктылыкны тотучы антенна комплексы яктылыкны сеңдергәндә һәм тоткарланган энергияне реакция үзәгенә (RC) күчергәндә башлана, шуның белән заряд аерылуы башлана (4-7). Шәмәхә фототрофик бактерияләрдә фотосинтезның төп берәмлеге 2 нче типтагы RCдан тора, ул яктылык җыючы 1 нче комплекс (LH1) белән әйләндереп алынган, RC-LH1 үзәк комплексын формалаштыра. LH1 ике бактерия хлорофилл (BChl) a молекуласына һәм бер яки ике каротиноидка бәйләнгән кәкре αβ гетеродимерлар массивы белән формалаша (8-12). Иң гади LH1 антеннасы RC (9-13) ябык циклда әйләндереп алган 16 яки 17 αβ гетеродимердан тора, ләкин башка үзәк комплексларда трансмембран пептидлар тирә-юньдәге LH1ның өзлексезлеген боза, шуның белән RC һәм цитохром bc1 комплексы арасында хинол/хинон диффузиясен көчәйтә (11, 13-15). Шәмәхә фототрофик үсемлек Rhodopseudomonas (Rps.) - фотосинтезны тәэмин итүче энергия һәм электрон күчерүен аңлый алучы модель организм. Rps-ның беренче кристалл структурасы. Palustris RC-LH1 комплексы моделе - RC, ул 15 гетеродимер LH1 элмәге белән әйләндереп алынган, алар "Protein W" дип аталган билгесез аксым белән өзелә (14). Соңрак Protein-W RPA4402 буларак билгеләнде, ул өч фаразланган трансмембран спиральләре (TMH) булган характерланмаган 10,5 кДа аксым (16). Без W аксымын кодлаучы rpa4402 генын RC-L, M (pufL, pufM) һәм LH1α, β (pufA, pufB) субберәмлекләрен кодлаучы номенклатурага туры килерлек итеп pufW дип үзгәртергә тәкъдим итәбез. Кызыклысы шунда ки, W аксымы RC-LH1ның якынча 10% ында гына бар, бу Rps. palustris ике төрле RC-LH1 комплексын җитештерә икәнен күрсәтә. Монда без ике үзәк комплексның югары сыйфатлы крио-ЭМ (cryo-ЭМ) структураларын күрсәтәбез, берсе W аксымы һәм 14 αβ гетеродимерлы, икенчесе W аксымы һәм ябык 16 гетеродимер LH1 элмәге булмаган. Безнең структура Rps. palustrisның RC-LH1 комплексын аңлауда адым үзгәрешен күрсәтә, чөнки без һәр вариантның гомоген популяциясен анализладык һәм һәр пептидны һәм бәйләнгән пигментларны, шулай ук ​​бәйле липидларны һәм хиноннарны ачык билгеләү өчен җитәрлек сыйфатка ия. Бу структураларны чагыштыру күрсәткәнчә, әлегә кадәр башка бернинди RC-LH1 комплексында да табылмаган өч TMH аксымы-W хинон/хинолон алмашынуын тизләтү өчен хинон каналын барлыкка китерә. Берничә сакланган липид һәм хинон бәйләнеш урыннары ачыкланды, һәм без хинон һәм RC кушылганнан соң яңа конформация үзгәрешен ачыкладык, бу кислородлы фототрофик организмнарның II фотосистемасы (PSII) RC өчен яраклы булырга мөмкин. Безнең ачышлар шәмәхә фототрофик бактерияләрнең RC-LH1 үзәк комплексында хинон/хинолон бәйләнеше һәм алмашу кинетикасына яңа күзаллау бирә.
Rps. palustris'та табылган ике комплексны җентекле өйрәнү өчен, без һәр RC-LH1'ны биохимик ысуллар белән аерып алабыз. Аксым W җитмәгән комплекс (алга таба ΔpufW дип атала) pufW гены булмаган штаммнан чистартылган (16), һәм бары тик бер RC-LH1 комплексы гына җитештерелә ала. Аксым W булган комплекс штамм белән җитештерелә. Бу штаммның W аксымы үзенең C-терминалында 10x His тегы белән модификацияләнә, шуңа күрә W булган аксым комплексын металлны иммобилизацияләү юлы белән күпчелек җитмәгән W аксымы белән нәтиҗәле берләштерергә мөмкин. Комплекс нәтиҗәле рәвештә аерыла (16) Аффинитет хроматографиясе (IMAC).
1 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, ике комплекс та LH1 антеннасы белән әйләндереп алынган өч субберәмлек RC (RC-L, RC-M һәм RC-H) үз эченә ала. Аксым-W булмаган комплексның 2.80-A структурасында 16 αβ гетеродимер күренә, алар RCны тулысынча әйләндереп алган ябык LH1 элмәген тәшкил итә, бу алга таба RC-LH116 комплексы дип атала. Аксым-W булган комплексның 2.65Å структурасында аксым-W белән өзелгән 14-гетеродимер LH1 бар, ул алга таба RC-LH114-W дип атала.
(A һәм B) Кушылманың өслек күренеше. (C һәм D) Таякчыкларда күрсәтелгән бәйләнгән пигментлар. (E һәм F) Цитоплазматик өслектән күзәтелгән комплекслар мультфильмнарда күрсәтелгән пептидларга һәм LH1 субберәмлекләренә ия, һәм алар аксым-W аралыгыннан сәгать теле юнәлешендә номерланган [Rba номерлавына туры килә. сфероидлар комплексы (13)]. LH1-α өчен аксым субберәмлегенең төсе сары; LH1-β өчен аксым субберәмлегенең төсе зәңгәр; аксым-W өчен аксым кызыл; RC-H өчен ул зәңгәрсу; RC-L өчен ул кызгылт сары; RC-M өчен кызгылт-сары. Кофакторлар таякчыклар белән күрсәтелгән, яшел BChl һәм BPh a молекулаларын, шәмәхә төс каротиноидларны, ә сары UQ10 молекулаларын күрсәтә. (G һәм H) RC-LH114-W комплексының (G) һәм RC-LH116 комплексының (H) эквивалент өлкәсендә аксым-W аралыгының зурайтылган күренеше. Кофакторлар бушлык тутыру рәвешендә күрсәтелә, хелатланган хинон зәңгәр төстә күрсәтелә. Аксым-W аралыгы (G) эчендә зәңгәр өзекле сызык белән билгеләнгән, ә хинон/хинолол LH116 боҗрасында тарала торган кечкенә тишекләр (H) эчендә кара өзекле сызык белән билгеләнгән.
1 нче рәсемдә (А һәм В) LH1αβ гетеродимерларының ачык яки ябык массивлары белән әйләндереп алынган RC күрсәтелгән, аларның һәрберсе ике BChl һәм бер каротиноид белән бәйләнә (1, С һәм D рәсемнәре). Элегрәк үткәрелгән тикшеренүләр Rps - LH1 комплексы булуын күрсәтте. Спирулина ксантинының биосинтетик юлында бу төрләрдә каротиноидларның катнаш популяцияләре бар (17). Ләкин спиропирроксантин доминант каротиноид булып тора һәм аның тыгызлыгы канәгатьләнерлек. Шуңа күрә без спироксантинны барлык LH1 бәйләнеш урыннарында да модельләштерергә булдык. Альфа һәм бета полипептидлары - кыска мембраналы тышкы өлкәләре булган бер TMH (1, А, В, Е һәм F рәсемнәре). С-терминалында 17 калдыкның тыгызлыгы күзәтелмәсә дә, альфа полипептид ике комплекста да Met1 дан Ala46 га кадәр аерылган. RC-LH116 да β полипептиды Gly4 тан Tyr52 га кадәр, ә RC-LH114-W да Ser5 тан Tyr52 га кадәр кимегән. 3 яки 4 N-терминаль яки 13 C-терминаль калдыкларының тыгызлыгы күзәтелмәгән (S1 рәсем). Кыргый типтагы штаммнан әзерләнгән катнаш RC-LH1 комплексының масса-спектрометрия анализы күрсәткәнчә, югалган өлкә бу пептидларның гетерологик бүленеше нәтиҗәсе (S1 һәм S2 рәсемнәре). α-Met1 нең N-терминаль формилизациясе дә күзәтелгән (f). Анализ күрсәткәнчә, α-пептид fMet1 дан Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 га кадәр калдыклардан тора, ә β-пептид Ser2 дан Ala53 га кадәр калдыклардан тора, бу түбән температуралы ЭМ тыгызлык картасы белән яхшы туры килә.
α-His29 һәм β-His36 координациясе BChlsны йөзгә-йөз тоташтыра; һәр αβ гетеродимеры күршеләре белән җыелып, RC тирәсендә ачык элмәк (RC-LH114-W) яки ябык элмәк (RC-LH116) барлыкка китерә. Экситон белән бәйләнгән пигмент массивы (1 нче рәсем, C һәм D). RC-LH114-Wның 877 нм диапазоны белән чагыштырганда, RC-LH116ның 880 нм абсорбция кызыл күчеше 3 нм тәшкил итә (2А рәсем). Ләкин, түгәрәк дихроизм спектры диярлек бер үк (2B рәсем, бу ачык һәм ябык элмәкләр арасында ачык аерма булса да, BChlsның локаль мохите бик охшаш икәнен күрсәтә. Абсорбция кызыл күчеше ябык элмәктә җылылык хәрәкәтенең кимүе һәм тотрыклылыкның артуы (18, 19), ябык элмәк аркасында пигмент бәйләнешенең үзгәрүе (20, 21) яки бу ике эффектның комбинациясе (11) нәтиҗәсе булырга мөмкин.
(A) Ультрафиолет/күренмәле/якын инфракызыл сеңү спектры, аның пиклары тиешле пигментлар белән билгеләнгән һәм 775 нмдагы BPh пигына нормальләштерелгән. (B) 805 нмдагы BChl сеңүенә нормальләштерелгән түгәрәк дихроизм спектры. (C һәм D) RC-LH114-W комплексының (C) һәм RC-LH116 комплексының (D) вакыт белән билгеләнгән сеңү спектрларыннан сайланган ΔA спектрлары. Яхшырак чагыштыру өчен, барлык спектрлар 0,2 псда −A ның ∆A га нормальләштерелгән. (E) UQ2 төрле концентрацияләре булганда нурландырудан соң цитохром c2 оксидлашу тизлеге (чимал мәгълүматлар өчен S8 рәсемен карагыз). (F) Түбән, уртача яки югары интенсивлыклы яктылык астында үстерелгән күзәнәкләрдә (тиешенчә 10, 30 яки 300μMm-2 s-1), чистартылган комплекстагы W һәм RC-L субберәмлекләре һәм аерылган мембрана нисбәте. SDS-полиакриламид геле электрофорезы һәм иммуноанализ ярдәмендә аксым дәрәҗәсен билгеләгез (чимал мәгълүматлар өчен S9 рәсемен карагыз). Чистартылган RC-LH114-W комплексына карата нисбәтне билгеләгез. Комплексның RC-L һәм аксым-W стехиометрик нисбәте 1:1 тәшкил итә.
RC-LH114-W деформацияләнгән αβ14 элмәгендәге 1 нче позициядәге BChl'лар (1 нче рәсем, A, C һәм E) RC беренчел донорына (P) RC-LH116'дагы эквивалент BChl'ларга караганда 6,8Å'га якынрак (1 нче рәсем, B, D һәм F, һәм S3 нче рәсем); ләкин, ике комплексның вакытлы абсорбция кинетикасы RC-LH114-W һәм RC-LH116 өчен LH1'дан RC'га кузгату энергиясе тапшыру вакыты константалары 40 ±4 һәм 44±3 ps булуын күрсәтә (2 нче рәсем). , C һәм D, S4 нче рәсем һәм S2 нче таблица). RC эчендә электрон тапшыруда да әһәмиятле аерма юк (S5 нче рәсем һәм бәйле өстәмә текст). LH1 һәм RC-P арасындагы энергия тапшыру вакытының якын туры килүе ике LH1 элмәгендәге күпчелек BChl'ларның охшаш ераклыгы, почмагы һәм потенциаль энергиясе белән бәйле дип фаразлыйбыз. LH1 энергия үрнәген минималь ераклыкка барып җитү өчен өйрәнү, энергияне субоптималь урыннардан RCга турыдан-туры күчерүдән тизрәк түгел кебек. RC-LH114-W'дагы ачык цикллы LH1 элмәге структураль анализ өчен түбән температура шартларында да әһәмиятсез җылылык хәрәкәтенә дучар булырга мөмкин, һәм бүлмә температурасында RC 1 позициясендәге βBChls пигментация ераклыгыннан озынрак αβ14 боҗра конформациясе бар.
RC-LH116 комплексы 32 BChl һәм 16 каротиноидны үз эченә ала, һәм аның гомуми урнашуы Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Аксым мәгълүматлары банкы (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 штаммыннан (PDB ID 7C9R) (12) һәм яшел суүсемнәрдән (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) алынган белән бер үк. Тигезләнгәннән соң, αβ гетеродимерлары позицияләрендә кечкенә тайпылышлар гына күзәтелде, бигрәк тә 1-5, 15 һәм 16 (S6 рәсем). W аксымы булуы LH1 структурасына зур йогынты ясый. Аның өч TMH кыска элмәкләр белән тоташкан, N-терминалы комплексның люмен ягында, ә C-терминалы цитоплазма ягында (1A һәм 3 рәсемнәр, A дан D га кадәр). Аксым-W күбесенчә гидрофоб (3B рәсем), һәм TMH2 һәм TMH3 LH1αβ-14 белән үзара бәйләнештә булып, трансмембран өслеген барлыкка китерә (3 нче рәсем, B һәм E - G). Интерфейс, нигездә, трансмембран өлкәсендәге Phe, Leu һәм Val калдыкларыннан тора. Бу калдыклар гидрофоб аминокислоталар һәм αβ-14 пигментлары белән капланган. Кайбер поляр калдыклар да үзара бәйләнешкә өлеш кертә, шул исәптән комплекс куышлыгы өслегендәге W-Thr68 һәм β-Trp42 арасындагы водород бәйләнеше (3 нче рәсем, F һәм G). Цитоплазма өслегендә Gln34 αβ-14 каротиноидларының кето төркеменә янәшә урнашкан. Моннан тыш, n-додецил β-d-мальтозид (β-DDM) молекуласы аерылган, һәм аның гидрофоб койрыгы аксым-W һәм αβ-14 арасындагы интерфейска кадәр сузылган, һәм липид койрыгы тәндә урнашкан булырга мөмкин. Шулай ук ​​без W аксымы һәм RCH-ның C-терминаль чишелеш өлкәләренең бик якын булуын, ләкин билгеле бер үзара тәэсир итешүләр формалаштыру даирәсенә кермәвен күрдек (1 нче рәсем, A һәм E). Ләкин, бу ике аксымның чишелмәгән C-терминаль аминокислоталарында үзара тәэсир итешүләр булырга мөмкин, бу RC-LH114-W комплексы җыелганда W аксымы җәлеп итү механизмын тәэмин итәргә мөмкин.
(A) LH1αβ14 белән чиктәшлеккә мультфильм рәвешендә караган Аксым-W электростатик потенциал диаграммасының бер өлешендә күрсәтелгән таякчык формасындагы ян чылбырга (кызыл) ия (контур дәрәҗәсе 0,13 булган үтә күренмәле соры өслек). (B) Аксым-W гидрофоб төсле өслек белән күрсәтелгән. Поляр һәм зарядлы өлкәләр зәңгәрсу төстә, гидрофоб өлкәләр ак төстә, ә көчле гидрофоб өлкәләр кызгылт сары төстә күрсәтелгән. (C һәм D) Аксым-W мультфильмда күрсәтелгән, аның юнәлеше (A) (C) белән бер үк һәм 180° (D) белән әйләндерелгән. Эзлеклелектәге позициягә карап, аерылып торган калдыклар салават күпере төс схемасын кулланалар, анда N-оч зәңгәр һәм C-оч кызыл. (E) Аксым-W (A) белән бер үк күренештә, һәм аксым-W:LH1 чикләрендәге калдыклар беркетелгән билгеләре булган таякчыклар белән күрсәтелгән. (F) Аксым-W мультфильм сурәтендә (E) һәм LH1αβ14 га карата 90° әйләндерелгән, һәм такта сурәтендә интерфейс калдыкларына карата. Бета-полипептидтан асылынып торган калдыклар билгеләнгән. Кофактор 1 нче рәсемдәге төскә туры килә торган такта рәвешендә күрсәтелгән, таркалган β-DDM соры төстә, ә кислород кызыл төстә күрсәтелгән. (G) (F) сурәте билгеләнгән альфа-полипептид калдыклары күренекле булган хәлдә 180° әйләндерелгән.
Protein-W αβ гетеродимерын (1F рәсемдә 15 нче) алыштыра, шуның белән элмәкнең ябылуын һәм беренче өч αβ гетеродимерының авышуын булдырмый. Беренче αβ-1 гетеродимерының пленка нормальенә карата максималь авышлык почмагы 25° - 29° булуы күзәтелде (1 нче рәсем, A һәм E), бу RC A кискен контрастлы-LH116'да αβ-1'ның 2° - 8° авышлыгы белән барлыкка килгән (1 нче рәсем, B һәм F). Икенче һәм өченче гетеродимерлар, тиешенчә, 12° - 22° һәм 5° - 10° авышлыкта. RC'ның стерик комачаулавы аркасында, αβ-1 авышлыгы αβ'ның икенче парын үз эченә алмый (1F рәсемдә 16 нчы αβ'ка туры килә), шулай итеп LH1 боҗрасында ачык ара барлыкка килә (1 нче рәсем, A һәм E). Ике αβ гетеродимеры булмау сәбәпле, дүрт BChl һәм ике каротиноид югалуы белән бергә, каротиноидларның берсе дә бөтерелгән αβ-1 субберәмлегенә бәйләнми, нәтиҗәдә LH114-W боҗрасында 13 каротиноид бар, алар арасында вегетариан һәм 28 BChl бар. αβ1 дән 7 гә кадәр өлкәләрдәге ике комплексның локаль чишелеш бәяләмәләре LH1 элмәгенең калган өлешенә караганда түбәнрәк, бу RC QB урынына янәшә урнашкан LH1 субберәмлегенең эчке пластиклыгын чагылдырырга мөмкин (4 нче рәсем).
RC-LH114-W (A һәм B) һәм RC-LH116 (C һәм D) рәсемнәре 1 нче рәсемдәге (B һәм D) бер үк өске/ян күренештән (A һәм B) (A һәм C) һәм куышлык өслегеннән күрсәтелгән. Төсле төймәләр уң якта күрсәтелгән.
Стехиометрик нисбәте 1:14 булган бердәнбер характерлы үзәк комплексы - Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димеры (13). Ләкин W һәм PufX аксымнарының ачык гомологиясе юк һәм алар үзләренең LH1 структураларына зур йогынты ясыйлар. PufX - N-терминаль цитоплазматик доменлы бер TMH, ул RC-H субберәмлегенең (13) цитоплазматик ягы белән Rps. palustris LH116αβ-16 га туры килә торган урында үзара бәйләнештә була. PufX RC-LH1 һәм цитохром bcl комплексы арасында хинон/хинолон алмашу өчен канал булдыра һәм барлык Rba.sphaeroides үзәк комплексында да бар (13). Мономер-мономер интерфейсы Rbaда булса да. RC-LH1-PufX димеры сфероидлары RC-LH114-W да W аксымының бәйләнеш позициясендә урнашкан, һәм PufX һәм W аксымнары белән индукцияләнгән ара эквивалент позициядә (S7A рәсем). RC-LH114-W да ара Pseudomonas rosea LH1 гипотетик хинон каналы (8) белән туры килә, ул W яки PufX аксымнары белән бәйле булмаган пептидлар белән формалаша (S7B рәсем). Моннан тыш, Blc да хинон каналы. Бер γ субберәмлеген (7) чыгарып формалашкан зөбәрҗәт яшел LH1 охшаш позициядә урнашкан (S7C рәсем). Төрле аксымнар ярдәмендә булса да, бу хинон/хинолол каналларының RC-LH1 комплексында уртак позициядә күренүе конвергент эволюциягә мисал булып тора, бу W аксымы тарафыннан барлыкка китерелгән араның хинон каналы буларак эш итәргә мөмкинлеген күрсәтә.
LH114-W элмәгендәге ара, аксымнардагы кебек аксым порошогы аша ике доменны тоташтыру урынына, RC-LH114-W комплексының эчке киңлеге һәм күләм мембранасы арасында өзлексез мембрана өлкәсен формалаштырырга мөмкинлек бирә (1G рәсем). RC-LH116 комплексы ябык Tch. Энә сыман комплексына охшаган (22) (1H рәсем). Хинонның мембрана аша диффузиясе тар аксым каналы аша диффузиягә караганда тизрәк булганлыктан, ачык LH114-W элмәге ябык LH116 элмәгенә караганда тизрәк RC әйләнешен тәэмин итә ала, һәм хинонның RCга диффузиясе чикләнгәнрәк булырга мөмкин. W аксымының RC аша хиноннарның конверсиясенә тәэсир итүен тикшерү өчен, без убихинон 2 (UQ2) (изопрен койрыгы кыскарак булган табигый UQ10 аналогы) билгеле бер концентрациясендә цитохром оксидлашу анализын үткәрдек (2E рәсем). Хелатланган хинон булу күренгән Михаэлис даимисен төгәл билгеләүгә комачауласа да (RC-LH114-W һәм RC-LH116 0,2±0,1μM һәм 0,5±0,2μM өчен яраклы), RC-LH114-W максималь тизлеге (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 дан (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) 28±5% ка зуррак.
Башта без аксым-W үзәк комплексының якынча 10% ында булуын исәпләдек (16); монда түбән яктылык, уртача яктылык һәм югары яктылык үсү күзәнәкләренең тулылык дәрәҗәсе 15±0,6%, 11±1% һәм 0,9±0,5% тәшкил итә (2F рәсем). Масса-спектрометриянең санлы чагыштырмасы гистидин билгесен өстәүнең кыргый типтагы штаммнар белән чагыштырганда аксым-W чагыштырмача күплеген киметмәвен күрсәтте (P = 0,59), шуңа күрә бу дәрәҗәләр модификацияләнгән аксым-W артефакты түгел (S10 рәсем). Ләкин, RC-LH1 комплексында аксым-Wның бу түбән тулылыгы кайбер RCларның тизләтелгән тизлектә әйләнүенә мөмкинлек бирә ала, шуның белән RC-LH116 комплексында хинон/хинолон алмашуының әкренрәк булуын киметә. Без югары яктылык тулылык дәрәҗәсенең соңгы транскриптомика мәгълүматлары белән туры килмәвен күрдек, бу көчле яктылык астында pufW ген экспрессиясенең артуын күрсәтә (S11 рәсем) (23). pufW транскрипциясе һәм RC-LH1 комплексына аксым-W кушылуы арасындагы аерма буталчык һәм аксымның комплекслы көйләнешен чагылдырырга мөмкин.
RC-LH114-W да 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерин (POPG) һәм 29 β-DDM молекуласы бүленеп алынган һәм анда 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG һәм 12 βDDM модельләштерелгән. RC-LH116 (5 нче рәсем, А һәм В). Бу ике структурада CDL комплексның цитоплазматик ягында диярлек урнашкан, ә POPC, POPG һәм β-DDM күбесенчә люминаль ягында урнашкан. RC-LH114-W комплексының αβ-1 - αβ-6 өлкәсендә ике липид һәм югыч матдә молекуласы изоляцияләнгән (5А рәсем), ә бишесе RC-LH116 эквивалент өлкәсендә изоляцияләнгән (5B рәсем). Комплексның икенче ягында, нигездә, CDL, RC һәм αβ-7 арасында тупланган күбрәк липидлар табылган (5 нче рәсем, А һәм В). Башка структураль яктан чишелешле липидлар һәм югыч матдәләр LH1 боҗрасыннан тыш урнашкан, һәм яхшы чишелешле ацил чылбырлары LH1 субберәмлекләре арасында сузыла, RC-LH114-W да шартлы рәвештә β-DDM дип билгеләнә һәм RC A β-DDM һәм POPC-LH116 катнашмасында β-DDM дип билгеләнә. Хелатлаштыручы липидлар һәм югыч матдәләрнең безнең структурадагы охшаш позицияләре аларның физиологик яктан мөһим бәйләнеш урыннары булуын күрсәтә (S12A рәсем). Tch да эквивалент молекулаларның позицияләре дә яхшы консистенциягә ия. Йомшак һәм Trv. 970 RC-LH1s штаммы (S12 рәсем, B - E) (9, 12) һәм липид баш төркеменең водород бәйләнеше калдыклары эзлеклелек тигезләнешендә шактый яхшы саклану күрсәтте (S13 рәсем), бу RC белән бәйләнгән CDL сакланганлыгын күрсәтә (24), бу урыннар RC-LH1 комплексында сакланырга мөмкин.
(A һәм B) RC-LH114-W (A) һәм RC-LH116 (B) пептидлары 1 нче рәсемдәге төс схемасы ярдәмендә мультфильмнар белән, ә пигментлар таякчыклар белән күрсәтелгән. Липидлар кызыл төс белән, ә югыч матдәләр соры төс белән күрсәтелгән. RC QA һәм QB урыннарына бәйләнгән UQ сары төстә, ә аерымланган UQ зәңгәр төстә. (C һәм D) (A) һәм (B) белән бер үк күренешләр, липидлар төшереп калдырылган. (E дан G га кадәр) RC-LH116 дан Q1(E), Q2(F) һәм Q3(G) ның зурайтылган күренеше, бер-берсенә тәэсир итүче ян чылбырлар белән. Водород бәйләнешләре кара пунктир сызыклар белән күрсәтелгән.
RC-LH116 да, зарядны аеру процессында электрон күчерүдә катнашучы RC QA һәм QB UQ икесе дә үзләренең бәйләнеш урыннарында таркала. Ләкин, RC-LH114-W да, QB хиноны ачыкланмаган һәм түбәндә җентекләп каралачак. QA һәм QB хиноннарыннан тыш, RC-LH114-W структурасында ике хелатланган UQ молекуласы (RC һәм LH1 боҗралары арасында урнашкан) аларның яхшы ачыкланган баш төркемнәренә карап (Q1 һәм Q2 да урнашкан) бүленгән. бушлык). 5C рәсем). Q1 га ике изопрен берәмлеге билгеләнгән, һәм тыгызлык картасы Q2 ның тулы 10 изопрен койрыгын ачыклый. RC-LH116 структурасында өч хелатланган UQ10 молекуласы (Q1 дән Q3 гә кадәр, 5D рәсем) ачыкланган, һәм барлык молекулаларның да койрык буйлап ачык тыгызлыгы бар (5 нче рәсем, D дан G га кадәр). Ике структурада да Q1 һәм Q2 хинон баш төркемнәренең урнашуы бик яхшы консистенциягә ия (S12F рәсеме), һәм алар бары тик RC белән генә үзара бәйләнештә булалар. Q1 RC-LH114-W W аралыгы керү урынында урнашкан (1G һәм 5 рәсемнәр, C, D һәм E), ә Q2 QB бәйләнеш урыны янында урнашкан (5 рәсем, C, D) һәм F). Сакланган L-Trp143 һәм L-Trp269 калдыклары Q1 һәм Q2 га бик якын һәм потенциаль π-өстәү үзара бәйләнешләрен тәэмин итә (5 рәсем, E һәм F рәсемнәр, һәм S12 рәсемнәр). Q1 дисталь кислородыннан 3,0 Å алынган L-Gln88 көчле водород бәйләнешен тәэмин итә (5E рәсем); бу калдык иң ерак бәйләнештән кала барлык RCларда да саклана (S13 рәсем). L-Ser91 күпчелек башка RCларда Thr урынына консерватив рәвештә кулланыла (S13 рәсем), Q1 метил кислородыннан 3,8 ангстрем тәшкил итә һәм көчсез водород бәйләнешләрен тәэмин итә ала (5E рәсем). Q3 билгеле бер үзара бәйләнешкә ия түгел кебек, ләкин RC-M субберәмлеге һәм LH1-α 5-6 субберәмлеге арасындагы гидрофоб өлкәдә урнашкан (5 рәсем, D һәм G). Q1, Q2 һәм Q3 яки якындагы хелатланган хиноннар шулай ук ​​Tch. Gentle, Trv. Strain 970 һәм Blc штаммнарында да эретелгән. Ирис структурасы (9, 10, 12) RC-LH1 комплексында сакланган ярдәмче хинон бәйләнеш урынына күрсәтә (S12G рәсем). RC-LH116 составындагы биш таркалган UQ югары нәтиҗәле сыек хроматография (HPLC) ярдәмендә билгеләнгән һәр комплексның 5,8±0,7 белән яхшы туры килә, ә RC-LH114-W составындагы өч таркалган UQ 6,2±0,3 үлчәнгән кыйммәттән түбәнрәк (S14 нче рәсем) структурада чишелмәгән UQ молекулалары барлыгын күрсәтә.
Псевдо-симметрик L һәм M полипептидларының һәрберсе биш TMH үз эченә ала һәм бер BChl димерын, ике BChl мономерын, ике бактериофаг (BPh) мономерын һәм бер гем булмаган тимерне һәм бер яки ике UQ10 молекуласын берләштергән гетеродимер барлыкка китерә. Терминаль кетон төркемендә водород бәйләнешләре булу һәм аның Rps'та билгеле туплануы аркасында, каротиноидлар цис-3,4-дегидрооргодопин дип аталган M-субберәмлегенә кертелә. Төрләр (25). RC-H тышкы мембрана өлкәсе мембранага бер TMH белән беркетелгән. RC'ның гомуми структурасы бәйле төрләрнең (мәсәлән, Rba) өч субберәмлеге RC'сына охшаш. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl һәм BPh макроцикллары, каротиноидлы нигез һәм гем булмаган тимер, шулай ук ​​QA урынындагы UQ10 баш төркеме һәм RC-LH116 урынындагы QB хинон (S15 нче рәсем) бу структураларның чишелеш диапазонында каплана.
Төрле QB урыннарында булу дәрәҗәсе булган ике RC структурасының булуы QB хинон бәйләнеше белән бергә барган конформация үзгәрешләрен тикшерү өчен яңа мөмкинлек бирә. RC-LH116 комплексында QB хиноны тулысынча бәйләнгән "якын" позициядә урнашкан (26), ләкин RC-LH114-W аерылышында QB хиноны юк. RC-LH114-W да QB хиноны юк, бу гаҗәпләндерә, чөнки комплекс актив, структураль яктан чишелгән QB хиноны булган RC-LH116 комплексына караганда күбрәк. Ике LH1 боҗрасы якынча алты хинонны хелатласа да, бишесе ябык RC-LH116 боҗрасында структураль яктан чишелгән, ә ачык RC-LH114-W боҗрасында структураль яктан өчесе генә чикләнгән. Бу структураль бозылуның артуы RC-LH114-W QB урыннарының тизрәк алышынуын, комплекста хинон кинетикасының тизрәк булуын һәм LH1 элмәген кисеп үтү ихтималының артуын чагылдырырга мөмкин. Без RC-LH114-W-ның RC QB урынында UQ булмавы катлаулырак һәм активрак комплекс нәтиҗәсе булырга мөмкин дип фаразлыйбыз, һәм RC-LH114-W-ның QB урыны шунда ук UQ әйләнешендә туңып калган. Конкрет этап (QB урынына керү ябылган) бу активлыкның конформациясен чагылдыра.
QB булмаганда, L-Phe217нең UQ10 бәйләнеше белән туры килмәгән позициягә әйләнүе, чөнки ул койрыкның беренче изопрен берәмлеге белән киңлек бәрелешүенә китерәчәк (6А рәсем). Моннан тыш, ачык төп конформация үзгәрешләре ачык күренә, аеруча спираль de (TMH D һәм E арасындагы элмәктәге кыска спираль), анда L-Phe217 QB бәйләнеш кесәсенә күчерелә һәм L-Tyr223 әйләнүе (6А рәсем) M-Asp45 каркасы белән водород бәйләнешен өзү һәм QB бәйләнеш урыны керүен ябу өчен (6Б рәсем). Спираль de әйләнүе нигезендә, L-Ser209ның Cα 0,33Å га күчә, ә L-Val221Cα 3,52Å га күчә. TMH D һәм E да күзәтелә торган үзгәрешләр юк, алар ике структурада да капланып тора (6А рәсем). Безнең белүебезчә, бу табигый RC'да QB урынын яба торган беренче структура. Тулы (QB белән бәйләнгән) структура белән чагыштыру күрсәткәнчә, хинон редукцияләнгәнче, аны хинонга кертү өчен конформация үзгәреше кирәк. L-Phe217 әйләнә һәм хинон баш төркеме белән π-өстәү үзара бәйләнешен барлыкка китерә, һәм спираль тышка күчә, бу L-Gly222 скелетына һәм L-Tyr223 ян чылбырына тотрыклы водород бәйләнеше структурасы белән водород бәйләнеше челтәрен формалаштырырга мөмкинлек бирә (6 нчы рәсем, А һәм С).
(A) Голограмма (L чылбыры, кызгылт сары/M чылбыры, кызгылт-сары) һәм апо (соры) структурасының капланган мультфильмы, анда төп калдыклар таякчыксыман күренеш рәвешендә күрсәтелгән. UQ10 сары сызык белән күрсәтелгән. Нүктәле сызык бөтен структурада барлыкка килгән водород бәйләнешләрен күрсәтә. (B һәм C) Аполипопротеинның һәм бөтен боҗра структурасының өслек күренеше, L-Phe217 ян чылбыр кислородын зәңгәр төстә һәм L-Tyr223 кызыл төстә аерып күрсәтә. L субберәмлеге кызгылт сары төстә; M һәм H субберәмлекләре төсләнмәгән. (D һәм E) Аполипопротеин (D) һәм бөтен (E) RC QB урыннары [тиешле рәвештә (A) буенча төс] һәм Thermophilus thermophilus PSII (яшел, зәңгәр пластик хинон белән; PDB ID: 3WU2) Тигезләгез (58).
Көтелмәгәнчә, LH1 булмаган QB җитмәгән RCларның берничә структурасы булса да, бу тикшеренүдә күзәтелгән конформация үзгәрешләре элек хәбәр ителмәгән. Алар арасында Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) һәм Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) дан QB кимү структурасы бар, алар барысы да гомуми QB структурасы белән диярлек бер үк. 3PRC ны җентекләп тикшерү LDAO (Лаурил Диметил Амин Оксиды) югыч матдә молекулаларының QB позициясенең керү урынында бәйләнүен күрсәтте, бу ябык конформациягә әйләнүне булдырмаска мөмкин. LDAO 1EYS яки 1OGV да бер үк позициядә таркалмаса да, бу RCлар бер үк югыч матдә кулланып әзерләнә һәм шуңа күрә бер үк эффект тудырырга мөмкин. Rba кристалл структурасы. Цитохром c2 белән бергә кристаллашкан Sphaeroides RC (PDB ID: 1L9B) да ябык QB сайтына ия кебек. Ләкин, бу очракта, RC-M полипептидының N-терминаль өлкәсе (Q спиралендәге Tyr калдыгының H бәйләнеше аша QB бәйләнеш урыны белән үзара бәйләнештә) табигый булмаган конформацияне кабул итә, һәм QB конформация үзгәреше алга таба өйрәнелми (30). Ышандыра торган нәрсә - без RC-LH114-W структурасында M полипептидының мондый деформациясен күрмәдек, бу RC-LH116 RCның N-терминаль өлкәсе белән диярлек бер үк. Шуны да билгеләп үтәргә кирәк, югыч порошок нигезендәге LH1 антеннасын бетергәннән соң, PDBдагы аполипопротеин RCлар юкка чыкты, бу RC һәм аны әйләндереп алган LH1 боҗрасының эчке өслеге арасындагы бушлыкта эчке хинон пулларын һәм липидларны юкка чыгарды (31, 32). RC функциональ булып кала, чөнки ул барлык кофакторларны саклый, таркала торган QB хиноныннан кала, ул азрак тотрыклы һәм еш кына әзерләү процессында югала (33). Моннан тыш, RCдан LH1 һәм табигый циклик липидларны чыгару функцияләргә, мәсәлән, заряд белән аерылган P+QB-халатының кыскару гомеренә тәэсир итә ала (31, 34, 35). Шуңа күрә, без RC тирәсендәге җирле LH1 боҗрасының булуы "ябык" QB урынын саклап калырга, шуның белән QB янындагы җирле мохитне сакларга мөмкин дип фаразлыйбыз.
Аполипопротеин (QB хиноныннан башка) һәм тулы структура QB урынының әйләнешенең берничә вакыйга сериясен түгел, ә ике генә чагылышын күрсәтсә дә, гидрохинон белән кабат бәйләнүен булдырмас өчен бәйләнешне контрольдә тотарга мөмкин дигән күрсәткечләр бар. Аполипопротеинның QB урыны янында хинолол һәм хинонның үзара тәэсире төрле булырга мөмкин, бу аның RC тарафыннан кире кагылуына китерә. Конформация үзгәрешләре хиноннарның бәйләнешендә һәм редукциясендә роль уйный дип күптән фаразлана. Караңгы адаптациядән соң туңдырылган RCларның хиноннарны редукцияләү сәләте бозыла (36); Рентген кристаллографиясе күрсәткәнчә, бу зыян QB хиноннарының актив проксималь позициядән якынча 4,5 Å ераклыкта "дисталь" конформациядә тотылуы белән бәйле (26), 37). Без бу дисталь бәйләнеш конформациясенең аполипопротеин һәм тулы боҗра структурасы арасындагы арадаш халәтнең чагылышы булуын фаразлыйбыз, ул хинон белән башлангыч үзара тәэсир итешүдән һәм QB урыны ачылудан соң бара.
Кайбер фототрофик бактерияләр һәм цианобактерияләр, суүсемнәр һәм үсемлекләрнең PSII комплексында табылган II типтагы RC структураль һәм функциональ саклануга ия (38). 6 нчы рәсемдә (D һәм E) күрсәтелгән структураль тигезләнеш PSII RC һәм бактерия RC комплексының QB урыны арасындагы охшашлыкны ассызыклый. Бу чагыштыру күптән инде хинон бәйләнеше һәм редукциясенең тыгыз бәйләнгән системаларын өйрәнү өчен модель булып тора. Элегерәк басмаларда конформация үзгәрешләре хиноннарның PSII редукциясе белән бергә бара дип фаразланган (39, 40). Шуңа күрә, RCның эволюцион сакланышын исәпкә алганда, бу элек күзәтелмәгән бәйләнеш механизмы кислородлы фототрофик үсемлекләрдә PSII RCның QB урынына да кагылырга мөмкин.
Rps ΔpufW (билгесез pufW бетерү) һәм PufW-His (табигый pufW локусыннан экспрессияләнгән C-терминалы 10x His-белгеләнгән аксым-W) штаммнары. palustris CGA009 безнең алдагы эшебездә тасвирланган иде (16). Бу штаммнар һәм изоген кыргый типтагы ата-ана туңдыргычтан PYE (һәрберсе 5 г литр -1) (LBда -80 °C температурада сакланган, составында 50% (w/v) глицерин) аксымы, чүпрә экстракты һәм сукцинат) агары [1,5% (w/v)] булган аз санлы күзәнәкләрне сызып алынган. Пластинка караңгыда бүлмә температурасында анаэроб шартларда төнлә инкубацияләнгән, аннары OSRAM 116-W галоген лампалары (RS Components, Бөекбритания) тарафыннан бирелгән ак яктылык (~50 мкмоль-2 с-1) белән 3-5 көн дәвамында бер колония барлыкка килгәнче яктыртылган. Бер колония 0,1% (w/v) казаминокислоталар (алга таба M22 дип атала) белән тулыландырылган 10 мл M22+ мохитен (41) имитацияләү өчен кулланылды. Культура караңгыда, 34°C температурада, 180 әйләнү/мин тизлегендә 48 сәгать дәвамында селкетеп үстерелде, аннары 70 мл культура шул ук шартларда 24 сәгать дәвамында имитацияләнде. 30 мл универсаль винтлы үтә күренмәле пыяла шешәдә 30 мл M22 мохитен имитацияләү өчен 1 мл күләмле ярым аэроб культура кулланыла һәм 48 сәгать дәвамында стериль магнит көче белән болгату таякчыгы белән болгатып (~50μmolm-2 s-1) нурландырылды. Аннары 30 мл культура шул ук шартларда якынча 1 литр культура белән имитацияләнде, аннары ул 72 сәгать дәвамында ~200 мкмольм-2 s-1 температурада яктыртылган якынча 9 литр культураны имитацияләү өчен кулланылды. Күзәнәкләр 7132 RCF температурада 30 минут дәвамында центрифугалау юлы белән җыелды, якынча 10 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эчендә кабат эретелде һәм кирәк булганчы -20°C температурада сакланды.
Эрегәннән соң, яңадан суспензияләнгән күзәнәкләргә дезоксирибонуклеаза I кристалларын (Merck, Бөекбритания), лизоцимны (Merck, Бөекбритания) һәм ике Roche голофермент протеаза ингибиторы таблеткаларын (Merck, Бөекбритания) өстәгез. 20,000 psi француз басымлы күзәнәктә (Aminco, АКШ) күзәнәкләр 8-12 тапкыр ватылган. Ватылмаган күзәнәкләрне һәм эреми торган калдыкларны 18,500 RCF температурада 4°C температурада 15 минут центрифугалау юлы белән алганнан соң, мембрана пигментлы лизаттан 113,000 RCF температурада 43,000°C температурада 2 сәгать центрифугалау юлы белән чөктерелгән. Эри торган фракцияне ташлагыз һәм төсле мембрананы 100-200 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эчендә яңадан суспензияләгез һәм күренмәле агрегатлар булмаганчы гомогенлаштырыгыз. Асылган мембрана 2% (w/v) β-DDM булган 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) (Anatrace, АКШ) эчендә караңгыда 4°C температурада 1 сәгать дәвамында әкрен генә болгатып инкубацияләнде. Аннары 70°C температурада 150,000 RCF эретү өчен 4°C температурада 1 сәгать дәвамында эретелде, эремәгән матдәләр юкка чыгарылды.
ΔpufW штаммыннан алынган эреткеч мембрана 50 мл DEAE Сефароза ион алмашу колоннасына өч колонка күләме (CV) бәйләү буферы [20 мМ трис-HCl (рН 8.0), составында 0.03% (w / v) β-DDM] булган бәйләү буферы белән кулланылды. Колоннаны ике CV бәйләү буферы белән юыгыз, аннары колоннаны 50 мМ NaCl булган ике бәйләү буферы белән юыгыз. RC-LH116 комплексы 1.75 CVда 150 дән 300 мМ NaCl сызыклы градиент белән (бәйләү буферында) элюцияләнде, ә калган бәйләү комплексы 0.5 CVда 300 мМ NaCl булган бәйләү буферы белән элюцияләнде. 250 һәм 1000 нм арасындагы абсорбция спектрын җыегыз, абсорбция коэффициенты (A880/A280) 1 дән зуррак булган фракцияне 880 - 280 нм диапазонда саклагыз, аны бәйләү буферында ике тапкыр суюлтыгыз һәм шул ук процедураны DEAE баганасында "Чистарту турында" кабат кулланыгыз. A880/A280 коэффициентлары 1,7 дән югарырак һәм A880/A805 коэффициентлары 3,0 дән югарырак булган фракцияләрне суюлтыгыз, ион алмашуның өченче раундын үткәрегез һәм A880/A280 коэффициентлары 2,2 дән югарырак һәм A880/A805 коэффициентлары 5,0 дән югарырак булган фракцияләрне саклагыз. Өлешчә чистартылган комплекс Amicon 100,000 молекуляр авырлыктагы кисү (MWCO) үзәктән качу фильтрында (Merck, Бөекбритания) якынча 2 мл га кадәр концентрацияләнгән һәм 200 мМ NaCl буферын үз эченә алган Superdex 200 16/600 зурлыктагы чыгару колонкасына (GE Healthcare, АКШ) йөкләнгән, аннары шул ук буферда 1,5 CV да элюцияләнгән. Зурлыктагы чыгару фракциясенең абсорбция спектрларын җыегыз һәм абсорбция спектрларын 2,4 һәм 5,8 дән 100 A880 га кадәр A880/A280 нисбәтләре белән A880/A805 нисбәтләре белән концентрацияләгез һәм аларны шунда ук крио-TEM челтәрен әзерләү яки саклау өчен кулланыгыз. Кирәк булганчы -80°C температурада саклагыз.
PufW-His штаммыннан алынган эреткеч мембрана IMAC буферындагы 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose колонкасына (200 мМ NaCl һәм 0,03% (w/w)) 200 мМ NaCl һәм 0,03% (w/w)) сөртелде. v) β-DDM]. Колонна биш CV IMAC буферы белән, аннары 10 мМ гистидинлы биш CV IMAC буферы белән юылды. Үзәк комплекс колонкадан 100 мМ гистидинлы биш IMAC буферы белән элюцияләнде. RC-LH114-W комплексын үз эченә алган фракция Amicon 100,000 MWCO фильтры (Merck, Бөекбритания) белән җиһазландырылган болгатылган бакта ~10 мл га кадәр концентрацияләнә, бәйләү буферы белән 20 тапкыр суюлтыла, аннары 25 мл га өстәлә. DEAE Sepharose колонкасында буферга бәйләнгән дүрт CV алдан кулланыла. Колонканы дүрт CV бәйләү буферы белән юыгыз, аннары комплексны сигез CVда 0 дән 100 мМ NaCl га кадәр сызыклы градиентта (бәйләү буферында) элюцияләгез, ә калган дүрт CVда 100 мМ бәйләү буферы бар. Натрий хлоридында элюцияләнгән калдык комплекслар A880/A280 нисбәте 2,4 тән югарырак һәм A880/A805 нисбәте 4,6 дән югарырак фракцияләр белән берләштерелеп, Amicon 100,000 MWCO үзәктән качу фильтрында ~2 мл га кадәр концентрацияләнде һәм алдан 1,5 CV IMAC белән тутырылды. Буфер Superdex 200 16/600 зурлыктагы чыгару колонкасын тигезләде, аннары шул ук буферда 1,5 CV өстендә элюцияләнде. Зурлык-чыгару фракцияләренең абсорбция спектрларын җыегыз һәм абсорбция спектрларын 2.1 дән артык A880/A280 һәм 4.6 дән артык A880/A805 нисбәтләре белән 100 A880 га кадәр туплагыз, алар шунда ук туңдырылган TEM рәшәткәсен әзерләү өчен кулланыла яки кирәк булганчы -80°C температурада саклана.
Түбән температуралы TEM челтәрләрен әзерләү өчен Leica EM GP батыру туңдыргычы кулланылды. Комплекс IMAC буферында A880 50 гә кадәр сыекландырылды, аннары 5 мкл яңа гына яктыртылган QUANTIFOIL 1.2/1.3 углерод белән капланган бакыр челтәренә (Agar Scientific, Бөекбритания) йөкләнде. Челтәрне 20°C температурада һәм 60% чагыштырма дымлылыкта 30 секунд инкубацияләгез, аннары 3 секунд киптерегез, аннары -176°C температурада сыек этанда сүндерегез.
RC-LH114-W комплексы мәгълүматлары eBIC (Электрон Биовизуализация Үзәге) (Британ Алмаз Яктылык Чыганагы) микроскобында 300 кВ тизләнеш көчәнешендә эшли торган, номиналь зурайтуы 130,000× һәм энергиясе 20 эВ булган Titan Krios микроскобы белән язып алынды. Мәгълүмат җыю өчен санау режимында сурәтләрне яздыру өчен K2 пик детекторы булган Gatan 968 GIF Quantum кулланылды. Калибрланган пиксель зурлыгы 1,048Å, ә доза ешлыгы 3,83 e-Å-2s-1. Плёнканы 11 секунд эчендә җыйдым һәм аны 40 өлешкә бүлдем. Микроскопны яңадан фокуслау өчен углерод белән капланган өлкәне кулланыгыз, аннары һәр тишеккә өч плёнка җыйдым. Барлыгы 3130 плёнка җыелды, дефокус кыйммәтләре -1 һәм -3 мкм арасында.
RC-LH116 комплексы өчен мәгълүматлар шул ук микроскоп ярдәмендә Астербери биоструктура лабораториясендә (Лидс университеты, Бөекбритания) җыелган. Мәгълүматлар санау режимында 130 к зурайту белән җыелган, ә пиксель зурлыгы 4,6 e-Å-2s-1 дозасы белән 1,065 Å га кадәр калибрланган. Фильм 12 секунд эчендә язылган һәм 48 өлешкә бүленгән. Барлыгы 3359 пленка җыелган, дефокус кыйммәтләре -1 дән -3 мкм га кадәр.
Барлык мәгълүматларны эшкәртү Relion 3.0 конвейерында (42) башкарыла. Доза авырлыгы ярдәмендә нур хәрәкәтен төзәтү өчен Motioncorr 2 (43) кулланыгыз, аннары CTF (контраст тапшыру функциясе) параметрын билгеләү өчен CTFFIND 4.1 (44) кулланыгыз. Бу башлангыч эшкәртү этапларыннан соң типик фотомикрографияләр 2 нче рәсемдә күрсәтелгән. S16. Автоматик сайлау шаблоны 250 пиксельле кадрда һәм ике үлчәмле (2D) классификациясез 1000 кисәкчәнең якынча 250 пикселен кул белән сайлау юлы белән булдырыла, шуның белән үрнәк пычрануына туры килә торган яки ачыклана торган үзенчәлекләре булмаган классификацияләрне кире кагалар. Аннары барлык микрофотографияләрдә автоматик сайлау башкарылды, һәм RC-LH114-W 849,359 кисәкчә, ә RC-LH116 комплексы 476,547 кисәкчә тәшкил итте. Сайланган барлык кисәкчәләр дә ике тапкыр сылтама булмаган 2D классификациясен үттеләр, һәм һәр тикшерүдән соң углерод өлкәсенә туры килгән кисәкчәләр, үрнәк пычрануы, ачык үзенчәлекләр булмаган яки нык капланган кисәкчәләр кире кагыла, нәтиҗәдә 772,033 (90,9%) һәм 359,678 (75,5%) кисәкчәләр RC-LH114-W һәм RC-LH116 3D классификациясе өчен кулланыла. Башлангыч 3D сылтама моделе стохастик градиент төшү ысулы белән булдырылды. Башлангыч модельне сылтама буларак кулланып, сайланган кисәкчәләр 3D форматында дүрт категориягә классификацияләнә. Бу категориядәге модельне сылтама буларак кулланып, иң зур категориядәге кисәкчәләрдә 3D чистарту үткәрегез, аннары эреткеч өлкәсен каплау өчен башлангыч 15Å түбән ешлыклы фильтр кулланыгыз, йомшак кырларның 6 пикселен өстәгез һәм өске детекторның Gatan K2 пик модуляциясе тапшыру функциясен төзәтү өчен пиксельләрне эшкәртегез. RC-LH114-W мәгълүматлар җыелмасы өчен бу башлангыч модель битлек кырыйларындагы көчле тыгызлыкны бетерү юлы белән үзгәртелде (UCSF Химерасындагы үзәк комплекс тыгызлыгыннан аерылган). Нәтиҗәдә барлыкка килгән модельләр (RC-LH114-W һәм RC-LH116 чишелешләре 3,91 һәм 4,16 Å) 3D классификациясенең икенче этабы өчен белешмә буларак кулланыла. Кулланылган кисәкчәләр башлангыч 3D классына төркемләнгән һәм күршелек белән көчле корреляцияне үз эченә алмый. Ачык структураль үзенчәлекләр каплана яки юк. 3D классификациясенең икенче этабыннан соң иң югары чишелешле категория сайланды [RC-LH114-W өчен бер категория 377,703 кисәкчәдән ​​тора (44,5%), RC-LH116 өчен барлыгы 260,752 кисәкчәдән ​​тора (54,7%), алар башлангыч әйләнештән соң кечкенә аерма белән тигезләнгәндә генә бер үк булалар]. Сайланган кисәкчәләр 400 пиксельле тартмада яңадан чыгарыла һәм 3D чистарту юлы белән чистартыла. Эреткеч битлеге башлангыч 15Å түбән үткәрүчәнлекле фильтр, 3 пиксельле карта киңәйтү һәм 3 пиксельле йомшак битлек ярдәмендә ясала. Һәр кисәкчәдән ​​CTF чистарту, һәр кисәкчәдән ​​хәрәкәт төзәтү һәм һәр кисәкчәдән ​​CTF чистартуның икенче этабын кулланып, һәр адымнан соң килеп чыккан текстураны тагын да чистарту өчен 3D чистарту, эреткеч маскировкасы һәм эшкәртү башкарыла. FSC (Фурье кабыгы корреляция коэффициенты) кисү кыйммәте 0,143 кулланып, RC-LH114-W һәм RC-LH116 соңгы модельләренең чишелешләре 2,65 һәм 2,80Å тәшкил итә. Соңгы модельнең FSC кәкресе 2 нче рәсемдә күрсәтелгән. S17.
Барлык аксым эзлеклелекләре UniProtKB'дан йөкләнә: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) RC-L, RC-M һәм RC-H аксым эзлеклелекләрен һәм Rba кристалл структурасын үз эченә алган RC гомология моделен төзү өчен кулланылды. sphaeroides RC шаблон буларак кулланылды (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera'дагы "картаны урнаштыру" коралын кулланып, генерацияләнгән модельне картага (47) туры китерегез, аксым структурасын яхшыртыгыз һәм кофакторны [4×BChlα (мономер китапханәсе калдыгы исеме = BCL), 2×BPhα (BPH), бер яки ике төр UQ10 (U10), бер гем булмаган тимер (Fe) һәм бер 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (QAK)] өстәгез. QAK мономер китапханәсендә булмаганлыктан, ул PHENIX'тагы (49) eLBOW коралы ярдәмендә параметрлаштырылды.
Аннары LH1 субберәмлеге төзелде. Башта PHENIX (49) графигындагы автоматик төзелеш коралы карта һәм LH1-α һәм LH1-β аксым эзлеклелекләрен кертеп, LH1 эзлеклелегенең бер өлешен автоматик рәвештә төзү өчен кулланылды. Иң тулы LH1 субберәмлеген сайлагыз, аны чыгарыгыз һәм Cootка йөкләгез, анда югалган эзлеклелекне кул белән өстәгез һәм ике BCl a (BCL) һәм спириллоксантин (CRT) өстәгәнче, бөтен структураны кул белән эшкәртегез [тиешле Rps буенча. LH1 комплексының тыгызлыгы һәм билгеле каротиноидлар эчтәлеге. Төрләр (17)]. Тулы LH1 субберәмлеген күчерегез һәм UCSF Chimera “Докинг Картасы Коралын” кулланып, LH1 тыгызлыгының күрше модель булмаган өлкәсенә урнаштырыгыз, аннары аны Cootта эшкәртегез; барлык LH1 субберәмлекләре модельләштерелгәнче процессны кабатлагыз. RC-LH114-W структурасы өчен, Coot'тагы бүленмәгән тыгызлыкны аерып алып, аксым USCF Химера картасындагы калган аксым булмаган компонентлардан сегментлана һәм Autobuild коралы башлангыч модельне, ә калган субберәмлекләрне (аксым-W) Модельләштерүне булдыру өчен кулланыла. PHENIX'та (49). Coot'та (48) килеп чыккан модельгә югалган эзлеклелекләрне өстәгез, аннары бөтен субберәмлекне кул белән эшкәртегез. Калган бүленмәгән тыгызлык липидлар комбинациясенә туры килә (CDL = CDL, POPC = 6PL һәм POPG = PGT PDB мономер китапханәсе ID), β-DDM югыч матдәсе (LMT) һәм UQ10 молекулалары (U10). Тулы башлангыч модельне камилләштерү өчен, модель статистикасын һәм туры килүнең визуаль сыйфатын тагын да яхшыртып булмаганчы, PHENIX оптимизациясен (49) һәм Coot'та (48) кул белән оптимизацияләүне кулланыгыз. Ниһаять, җирле картаны төгәлләштерү өчен LocScale (50) кулланыгыз, аннары бүленмәгән тыгызлыкны модельләштерүнең берничә башка циклын, шулай ук ​​автоматик һәм кул белән оптимизацияләүне башкарыгыз.
Тиешле пептидлар, кофакторлар һәм башка липидлар һәм хиноннар үзләренең тыгызлыкларында урнашкан 1 һәм 2 нче рәсемнәрдә күрсәтелгән. S18 - S23. Соңгы модельнең статистик мәгълүматы S1 таблицасында күрсәтелгән.
Башкача күрсәтелмәгән очракта, UV/Vis/NIR сеңдерү спектрлары Cary60 спектрофотометрында (Agilent, АКШ) 250 нм-нан 1000 нм-га кадәр 1 нм интервалларда һәм 0,1 с интеграция вакытында җыелды.
Үрнәкне 2 мм юл белән кварц кюветасында A880 1 гә кадәр суюлтыгыз һәм 400 һәм 1000 нм арасындагы абсорбция спектрын җыегыз. Түгәрәк дихроик спектрлар Jasco 810 спектрополяриметрында (Jasco, Япония) 400 нм һәм 950 нм арасындагы 1 нм интервалларда 20 нм мин-1 сканерлау тизлегендә җыелды.
Моляр сүнү коэффициенты үзәк комплексын якынча 50 A880 гә кадәр сыекландыру юлы белән билгеләнә. 10 мкл күләмне 990 мкл бәйләү буферында яки метанолда сыеклагыз һәм BChl деградациясен минимальләштерү өчен шунда ук абсорбция спектрын җыегыз. Һәр метанол үрнәгенең BChl эчтәлеге 54,8 мМ-1 см-1 771 нмдагы сүнү коэффициенты белән исәпләнде, һәм сүнү коэффициенты билгеләнде (51). Үзәк комплекс концентрациясен билгеләү өчен үлчәнгән BChl концентрациясен 32 гә (RC-LH114-W) яки 36 га (RC-LH116) бүлегез, аннары ул буферда җыелган шул ук үрнәкнең абсорбция спектрын билгеләү өчен кулланыла. Сүнү коэффициенты. параллель рәвештә. Һәр үрнәк өчен өч тапкыр үлчәү үткәрелде, һәм исәпләү өчен BChl Qy максимумының уртача абсорбциясе кулланылды. 878 нм да үлчәнгән RC-LH114-W сүнү коэффициенты 3280±140 мМ-1 см-1 тәшкил итә, ә 880 нм да үлчәнгән RC-LH116 сүнү коэффициенты 3800±30 мМ-1 см-1 тәшкил итә.
UQ10 (52) ысулы буенча санлаштырылды. Кыскасы, кире фазалы HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC системасы ярдәмендә башкарылды. Якынча 0,02 нмоль RC-LH116 яки RC-LH114-W 0,02% (w/v) тимер хлориды булган 50 мкл 50:50 метанол:хлороформда эретегез һәм алдан тигезләнгән Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 мм ны × 25 см колонкага 40°C температурада 1 мл-1 мин-1 эчендә HPLC эреткече (80:20 метанол:2-пропанол) эчендә эретегез. 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидлар) һәм 780 нм (BChl) абсорбциясен күзәтү өчен HPLC эреткече эчендә изократик элюция үткәрегез. 275 нм хроматограммадагы пик 25,5 минутта интеграцияләнгән, анда башка ачыкланырга мөмкин булган кушылмалар булмаган. Интеграль мәйдан 0 дән 5,8 нмоль га кадәр саф стандартларны кертүдән исәпләнгән калибрлау кәкресенә сылтама белән алынган UQ10 моляр күләмен исәпләү өчен кулланыла (S14 нче рәсем). Һәр үрнәк өч тапкыр анализланган, һәм күрсәтелгән хата уртача күрсәткечнең SD га туры килә.
30 мкМ киметелгән ат йөрәге цитохромы c2 (Merck, Бөекбритания) һәм 0 дән 50 мкMUQ2 га кадәр (Merck, Бөекбритания) кулланып, максималь Qy абсорбциясе 0,1 булган RC-LH1 комплексы булган эремә әзерләнде. Һәр UQ2 концентрациясендә өч 1 мл үрнәк әзерләнде һәм үлчәү алдыннан караңгылыкка тулысынча җайлашуны тәэмин итү өчен караңгыда 4°C температурада төнлә инкубацияләнде. Эремә 300 нм ялкын/500 сызыклы рәшәткә, 1,24 мм керү, 0,12 мм урта һәм 0,6 мм чыгу ярыклары белән җиһазландырылган OLIS RSM1000 модульле спектрофотометрына тутырылды. Кузгату яктылыкын чыгарыр өчен, үрнәк фототүбәсе һәм эталон фотокүбәйтү трубкасы керүенә 600 нм озынлыктагы үткәрүчән фильтр урнаштырылды. Абсорбция 550 нмда 0,15 с интеграция вакыты белән күзәтелде. Кузгату яктылык 880 нм M880F2 LED (Яктылык чыгаручы диод) (Thorlabs Ltd., Бөекбритания) аша 90% интенсивлыкта DC2200 контроллеры (Thorlabs Ltd., Бөекбритания) аша оптик җепсел кабель аша чыгарыла һәм яктылык чыганагына 90° почмакта чыгарыла. Үлчәү нуры башта үрнәк тарафыннан сеңдерелмәгән яктылыкны кире кайтару өчен көзгегә каршы куела. Яктырту 50 секундка җиткәнче, сеңдерүне 10 секунд күзәтегез. Аннары сеңдерү караңгыда 60 секунд дәвамында хинололның цитохром c23+ ны үзеннән-үзе киметү дәрәҗәсен бәяләү өчен күзәтелде (чимал мәгълүматлар өчен S8 рәсемен карагыз).
Мәгълүматлар 0,5-10 секунд эчендә сызыклы башлангыч тизлекне урнаштыру (UQ2 концентрациясенә карап) һәм һәр UQ2 концентрациясендә өч үрнәкнең дә тизлекләрен уртача исәпләү юлы белән эшкәртелде. Тиешле сүнү коэффициенты белән исәпләнгән RC-LH1 концентрациясе тизлекне каталитик нәтиҗәлелеккә әйләндерү өчен кулланылды, ул Origin Pro 2019 (OriginLab, АКШ) программасында күрсәтелгән һәм күренгән Km һәм Kcat кыйммәтләрен билгеләү өчен Michaelis-Menten моделенә урнаштырылган.
Вакытлыча абсорбция үлчәүләре өчен, RC-LH1 үрнәге 50 мМ натрий аскорбаты (Merck, АКШ) һәм 0,4 мМ Тербутин (Merck, АКШ) булган IMAC буферында ~2μM кадәр сыекландырылды. Аскорбин кислотасы корбан электрон доноры буларак кулланыла, ә терт-бутаклофен QB ингибиторы буларак кулланыла, төп RC доноры үлчәү процессы дәвамында кимегән килеш калуын (ягъни фотооксидланмаганлыгын) тәэмин итү өчен. Лазер юлындагы үрнәкнең кузгату импульслары арасында караңгы адаптация өчен җитәрлек вакыты булуын тәэмин итү өчен, 2 мм оптик юл озынлыгы булган махсус әйләнүче күзәнәккә (диаметры якынча 0,1 м, 350 RPM) якынча 3 мл үрнәк өстәлә. Үлчәүне 880 нм ешлыкта 1 кГц кабатлау тизлегендә (NIR өчен 20 нДж яки Vis өчен 100 нДж) кузгату өчен Ti: Sapphire лазер системасын (Spectra Physics, АКШ) көчәйтү өчен ~100-fs лазер импульсларын кулланыгыз. Мәгълүмат җыю алдыннан, үрнәкне якынча 30 минутка кузгату яктылыкына дучар итегез. Экспозиция QA инактивациясенә китерәчәк (ихтимал, QA бер яки ике тапкыр киметәчәк). Ләкин, зинһар, бу процесс кире кайтарыла икәнен истә тотыгыз, чөнки озак вакыт караңгы адаптациядән соң, RC әкренләп QA активлыгына кайта. -10нан 7000 psка кадәр тоткарлык вакыты белән вакытлыча спектрларны үлчәү өчен Helios спектрометры (Ultrafast Systems, АКШ) кулланылды. Мәгълүмат җыелмаларын төркемнән аеру, аннары берләштерү һәм стандартлаштыру өчен Surface Xplorer программасын (Ultrafast Systems, АКШ) кулланыгыз. Таркалуга бәйле дифференциаль спектрларны алу өчен берләштерелгән мәгълүмат җыелмасын куллану өчен CarpetView программа пакетын (Light Conversion Ltd., Литва) кулланыгыз, яки Origin (OriginLab, АКШ) бер дулкын озынлыгындагы спектраль эволюциягә туры килү өчен берничә экспонентны корал җавабы белән берләштерә торган функция кулланыгыз.
Югарыда әйтелгәнчә (53), RC һәм периферик LH2 антеннасы булмаган LH1 комплексы булган фотосинтетик пленка әзерләнде. Мембрана 20 мМ трис (рН 8.0) белән суюлтылды, аннары 2 мм оптик юлы булган кварц кюветына йөкләнде. 30нДж лазер импульсы үрнәкне 540 нмда -10 нан 7000 пс га кадәр тоткарлык вакыты белән кузгату өчен кулланылды. Мәгълүматлар җыелмасын Rps. pal үрнәге өчен тасвирланганча эшкәртегез.
Мембрана 150,000 RCF температурада 4°C температурада 2 сәгать дәвамында центрифугалау юлы белән бөртекләнде, аннары аның 880 нмдагы абсорбциясе 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) һәм 200 мМ NaCl да яңадан суспензияләнде. Мембрананы 2% (w/v) β-DDM белән караңгыда 4°C температурада 1 сәгать дәвамында әкренләп болгатып эретегез. Үрнәк 100 мМ триэтиламмоний карбонатында (рН 8.0) (TEAB; Merck, Бөекбритания) 2.5 мг мл-1 аксым концентрациясенә кадәр сыекландырылды (Bio-Rad анализы). Алга таба эшкәртү элек бастырылган ысул буенча (54) башкарылды, 50 мкг аксымны 1% (w/v) натрий лаураты булган барлыгы 50 мкл TEABка сыекландырудан башланды (Merck, Бөекбритания). 60 секунд дәвамында ультратавыш белән эшкәртүдән соң, ул 37°C температурада 30 минут дәвамында 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (Merck, Бөекбритания) белән киметелде. S-алкиллаштыру өчен, үрнәкне 10 мМ метил S-метилтиометансульфонат (Merck, Бөекбритания) белән инкубацияләгез һәм аны 200 мМ изопропанол эремәсеннән бүлмә температурасында 10 минут өстәгез. Протеолитик эшкәртү 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C катнашмасын (Promega Бөекбритания) өстәп башкарылды һәм 37°C температурада 3 сәгать инкубацияләнде. Лаурат өслек актив матдәсе 50 мкл этил ацетаты һәм 10 мкл 10% (v/v) LC класслы трифторуксус кислотасы (TFA; Thermo Fisher Scientific, Бөекбритания) өстәп һәм 60 секунд дәвамында вортекслап чыгарылды. Фазаларны аеру 15,700 RCF'та 5 минут дәвамында центрифугалау ярдәмендә алга китте. Җитештерүче протоколы нигезендә, пептид булган түбән фазаны җентекләп аспирацияләү һәм тозсызландыру өчен C18 спин колонкасы (Thermo Fisher Scientific, Бөекбритания) кулланылды. Вакуум центрифугалау ярдәмендә киптергәннән соң, үрнәк 0,5% TFA һәм 3% ацетонитрилда эретелде, ә 500 нг элек җентекләп тасвирланган система параметрларын кулланып, масса-спектрометрия белән берлектә нанофлюг RP хроматографиясе ярдәмендә анализланды.
Rps. palustris proteome мәгълүмат базасын эзләү өчен аксымнарны идентификацияләү һәм санлаштыру өчен MaxQuant v.1.5.3.30 (56) кулланыгыз (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Масса-спектрометрия протеомикасы мәгълүматлары PXD020402 мәгълүматлар җыелмасы идентификаторы астында PRIDE партнер репозиторийы (http://proteomecentral.proteomexchange.org) аша ProteomeXchange Allianceка урнаштырылды.
RPLC ярдәмендә электроспрей ионизация масса-спектрометриясе белән берлектә анализлау өчен, RC-LH1 комплексы кыргый типтагы Rps'тан әзерләнде. Элегрәк бастырылган ысулны (16) кулланып, palustris күзәнәкләрендә җитештерелгән аксым концентрациясе 20 мМ Hepes (рН 7.8), 100 мМ NaCl һәм 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad анализы)) DDM'да 2 мг мл-1 тәшкил итте. Җитештерүче протоколы буенча, 10 мкг аксымны төшерү ысулы белән аеру өчен 2D чистарту комплектын (GE Healthcare, АКШ) кулланыгыз һәм утырманы 20 мкл 60% (v/v) корыч кислотасында (FA), 20% (v/v) ацетонитрилда һәм 20% (v/v) суда эретегез. Биш микролитр RPLC (Dionex RSLC) ярдәмендә һәм масса-спектрометрия (Maxis UHR-TOF, Bruker) белән берлектә анализланды. 60°C һәм 100μlmin -1 температурада аеру өчен MabPac 1.2×100 мм колонкасын (Thermo Fisher Scientific, Бөекбритания) кулланыгыз, 85% (v / v) эреткеч A [0.1% (v / v) FA һәм 0.02% (v/v) TFA су эремәсе] градиенты белән, 85% (v/v) эреткеч B [90% (v/v) ацетонитрил TFAда 0.1% (v/v) FA һәм 0.02% (v/v)] градиенты белән. Стандарт электроспрей ионизация чыганагын һәм гадәти параметрларны 60 минуттан артык кулланып, масса-спектрометр 100 дән 2750 м/з га кадәр (масса-заряд нисбәте) ала. ExPASy биоинформатика ресурс порталы FindPept коралы (https://web.expasy.org/findpept/) ярдәмендә, масса спектрын комплексның субберәмлекләренә күчерегез.
Күзәнәкләр 100 мл NF-түбән (10μMm-2 s-1), уртача (30μMm-2 s-1) яки югары (300μMm-2 s-1) яктылык астында 72 сәгать үстерелде. M22 мохите (аммоний сульфаты кертелмәгән һәм натрий сукцинаты натрий ацетаты белән алыштырылган M22 мохите) 100 мл винтлы шешәдә (23). Биш 30 секундлык циклда күзәнәкләрне лизислау өчен 0,1 микронлы пыяла шарчыклар 1:1 күләм нисбәтендә шарчыкланды һәм 5 минут бозда суытылды. Эремәгән матдә, ватылмаган күзәнәкләр һәм пыяла шарчыклар өстәл микроцентрифугасында 16,000 RCF'та 10 минут центрифугалау юлы белән алынды. Мембрана Ti 70.1 роторында 100,000 RCF белән 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эчендә 40/15% (w/w) сахароза градиентында 10 сәгать дәвамында аерылды.
Алдагы эшебездә тасвирланганча, PufW'да His тегын иммунодетекцияләү (16). Кыскасы, 2x SDS йөкләү буферында (Merck, Бөекбритания) чистартылган үзәк комплексы (11,8 нМ) яки шул ук концентрацияле RC булган мембрана (оксидлашу юлы белән билгеләнә, киметелгән аерма спектрын алып ташлау һәм буялган гельдәге йөкләнешне туры китерү) ике тапкыр суюлтылды. Аксымнар 12% бис-трис NuPage геленда (Thermo Fisher Scientific, Бөекбритания) аерылды. RC-L субберәмлеген йөкләү һәм визуализацияләү өчен гель Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Бөекбритания) белән буялды. Икенче гельдәге аксым иммуноанализ өчен метанол белән активлаштырылган поливинилиден фторид (PVDF) мембранасына (Thermo Fisher Scientific, Бөекбритания) күчерелде. PVDF мембранасы 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 һәм 5% (w / v) майсызландырылган коры сөттә блокланган, аннары анти-His беренчел антитәнчеге белән инкубацияләнгән (Dlute the antitela bufer [50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl һәм 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, АКШ) 4 сәгать дәвамында. Антитәнчек буферында 3 тапкыр 5 минут юганнан соң, мембрана хрен пероксидазасы (Sigma-Aldrich, Бөекбритания) белән кушылды, тычканга каршы икенчел антитәнчек (антитәнчек буферында 1:10,000 нисбәтендә суюлтылды). Аныклау өчен (антитәнчек буферында 3 тапкыр юганнан соң 5 минут) WESTAR ETA C 2.0 хемилюминесценция субстраты (Cyanagen, Италия) һәм Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Бөекбритания) кулланып инкубацияләнде.
ImageJ (57) программасында һәр буялган гель яки иммуноанализ полосасының интенсивлык бүленешен сызып, пик астындагы мәйданны интегральләштереп һәм RC-L (буялган гель) һәм Protein-W (иммуноанализ) интенсивлык нисбәтен исәпләп, рәсемне эшкәртегез. Бу нисбәтләр моляр нисбәтләргә әйләндерелде, саф RC-LH114-W үрнәгендә RC-L һәм протеин-W нисбәте 1:1 дип фаразланды һәм барлык мәгълүматлар җыелмасын шуңа туры китереп нормальләштерелде.
Бу мәкалә өчен өстәмә материаллар белән http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 сылтамасы буенча танышырга мөмкин.
Бу мәкалә Creative Commons Attribution лицензиясе шартлары нигезендә таратыла торган ачык керү мөмкинлегенә ия. Мәкалә, оригиналь әсәр дөрес сылтама белән күрсәтелгән очракта, теләсә нинди материалда чикләүсез куллануга, таратуга һәм күчереп алырга рөхсәт ителә.
Искәрмә: Без сездән электрон почта адресыгызны гына сорыйбыз, шуңа күрә сез биткә тәкъдим иткән кеше сезнең электрон хатны күрүен теләвегезне һәм аның спам түгеллеген белсен. Без бернинди электрон почта адресларын да теркәмәячәкбез.
Бу сорау сезнең кунак булу-булмавыгызны тикшерү һәм спамның автоматик рәвештә җибәрелүен булдырмау өчен кулланыла.
Дэвид Дж.К. Свейнсбери, Парк Цян, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Ниджвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Реакция үзәгендәге яктылык тозагы 1 комплексының югары сыйфатлы структурасы хинон динамикасына яңа күзаллау бирә.
Дэвид Дж.К. Свейнсбери, Парк Цян, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Ниджвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Реакция үзәгендәге яктылык тозагы 1 комплексының югары сыйфатлы структурасы хинон динамикасына яңа күзаллау бирә.
© 2021 Фән үсеше өчен Америка Ассоциациясе. барлык хокуклар сакланган. AAAS - HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef һәм COUNTER партнеры. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.